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May 07, 2023

Estructura y mecanismo del alcano.

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2180 (2023) Citar este artículo

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Los alcanos son la forma de carbono más rica en energía y están ampliamente dispersos en el medio ambiente. Su transformación por microbios representa un paso clave en el ciclo global del carbono. La alcano monooxigenasa (AlkB), una metaloenzima que atraviesa la membrana, convierte los alcanos de cadena lineal en alcoholes en el primer paso de la degradación de alcanos mediada por microbios, desempeñando así un papel fundamental en el ciclo global del carbono y la biorremediación del petróleo. La biodiversidad de AlkB se atribuye a su capacidad para oxidar alcanos de varias longitudes de cadena, mientras que los AlkB individuales se dirigen a un rango relativamente estrecho. Los mecanismos de selectividad de sustrato y actividad catalítica siguen siendo esquivos. Aquí informamos la estructura crio-EM de AlkB, que proporciona una arquitectura distinta para las enzimas de membrana. Nuestros estudios estructurales y funcionales revelan una configuración inesperada del centro de dihierro e identifican determinantes moleculares para la selectividad del sustrato. Estos hallazgos brindan información sobre el mecanismo catalítico de AlkB y arrojan luz sobre su función en los microorganismos que degradan alcanos.

Los hidrocarburos son ubicuos. Cada año se liberan hasta 800 millones de toneladas a través de una combinación de filtraciones naturales, liberaciones accidentales de la industria del petróleo y la actividad biológica de las cianobacterias1,2,3. Estas moléculas son una rica fuente de alimento para las bacterias metabolizadoras de hidrocarburos y tienen un gran impacto en los ecosistemas4,5. En consecuencia, un paso indispensable en el ciclo del carbono es la transformación enzimática de alcanos líquidos para hacerlos biológicamente útiles.

Las bacterias que pueden metabolizar alcanos líquidos se encuentran en todo el mundo, desde la región ecuatorial6,7 hasta los golfos afectados por el petróleo8 y los suelos vírgenes ricos en hidrocarburos del Ártico y la Antártida7,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21,22. En estos entornos, la enzima principal que cataliza la oxidación de los alcanos líquidos es la alcano monooxigenasa (AlkB). AlkB oxida una variedad de alcanos de cadena lineal y está muy extendido en diversas bacterias que usan alcanos como su única fuente de carbono y energía10,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37. De hecho, fue el gen expresado de manera más diferencial en la comunidad microbiana que creció rápidamente después del derrame de petróleo de Deepwater Horizon38.

AlkB pertenece a la superfamilia similar a la desaturasa de ácidos grasos de membrana (FADS), que representa un grupo de monooxigenasas de dihierro no hemo que desaturan o hidroxilan cadenas alifáticas de acilo graso39. Reflejando la plasticidad catalítica de la superfamilia tipo FADS de membrana, AlkB hidroxila selectivamente el grupo metilo terminal de los alcanos de cadena lineal; otros miembros de la familia introducen enlaces dobles o grupos hidroxilo en sustratos basados ​​en lípidos, respectivamente. El primer vistazo a la estructura de estos biocatalizadores únicos fue proporcionado por las estructuras de la estearoil-CoA desaturasa SCD1 de mamíferos y la esfingolípido α-hidroxilasa de levadura Scs7p40,41,42,43. Excepto por los motivos característicos ricos en histidina, AlkB no comparte similitudes de secuencia significativas o socios de transferencia de electrones con esas dos familias de enzimas de ácidos grasos. La configuración exacta del centro de dihierro de AlkB sigue sin estar clara. También se han identificado AlkB funcionales en géneros patógenos, como Mycobacterium tuberculosis H37RV, Legionella pneumophilia cepa Filadelfia y Pseudomonas aeruginosa PAO131,36,44, lo que sugiere que AlkB puede impulsar el crecimiento de patógenos36. Se han identificado más de 20 000 secuencias de proteínas AlkB, lo que refleja su amplia distribución entre microorganismos.

A pesar de su importancia fundamental para el ciclo global del carbono y para la salud humana, el mecanismo catalítico de AlkB sigue siendo un misterio y la estructura de la enzima aún no se ha determinado experimentalmente. Las preguntas mecanicistas centrales siguen sin respuesta: qué características diferencian a AlkB de las enzimas de ácidos grasos y le permiten hidroxilar selectivamente el grupo metilo terminal de los alcanos lineales; qué características diferencian a un AlkB de otro, lo que, a su vez, dota a toda la familia de una gama de sustratos notablemente amplia que la convierte en una piedra angular en el ciclo global del carbono. La escasez de información ha dejado una brecha sustancial en nuestra comprensión de cómo la estructura de AlkB facilita su función y ha dificultado en gran medida su aplicación a la biotecnología.

AlkB es una de un número relativamente pequeño de enzimas cuya función establecida es transformar alcanos en alcoholes en condiciones ambientales (Fig. 1a). Esta es una reacción químicamente difícil debido a la naturaleza no polar del enlace CH y su gran energía de disociación, así como a los desafíos asociados con la activación selectiva de O2. Otras enzimas oxidantes de alcanos incluyen partículas de metano monooxigenasas que contienen cobre (pMMO), enzimas del citocromo P450 que contienen hemo, dos enzimas dependientes de flavina LadA y AlmA45, y otra enzima dihierro que no es hemo, la metano monooxigenasa soluble (sMMO). AlkB es única entre las enzimas oxidantes de alcanos porque presenta un entorno de ligando rico en nitrógeno que rodea el centro metálico; las otras enzimas de dihierro no hemo tienen centros de hierro ricos en carboxilatos. Esto sugiere que AlkB tiene un mecanismo catalítico distinto. Dado que décadas de estudios funcionales no han logrado definir este mecanismo, buscamos obtener información estructural sobre su sitio activo.

a Pasos clave en la degradación biológica de los alcanos. Los AlkB inician el metabolismo de los alcanos al transformar los alcanos en alcoholes. b Actividad de hidroxilación de alcanos de FtAlkB en octano. Un perfil representativo de GC-MS del pico de octanol de FtAlkB (negro) y control negativo sin FtAlkB (rojo). Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente y se observaron resultados similares. La actividad de la proteína purificada corresponde a 225 números de recambio o 5 μmoles de producto por mg de proteína. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Ocupación de hierro de FtAlkB determinada por ICP-MS (NC, control negativo; media ± SEM; n = 3 experimentos independientes). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d Mapa de densidad Cryo-EM del complejo FtAlkB-nanocuerpo. e Estructura general de FtAlkB, vista paralela a la membrana. Dos átomos de hierro se muestran como esferas de oliva.

Aquí, informamos una estructura crio-EM de AlkB y caracterizaciones concomitantes de sus actividades catalíticas. Nuestro estudio revela la arquitectura de esta familia de enzimas, las características clave del centro de dihierro y los determinantes moleculares de la selectividad de subestado, que ayudan a reconciliar más de 50 años de datos sobre este importante pero esquivo impulsor del ciclo global del carbono.

Para facilitar los estudios estructurales de AlkB, caracterizamos sistemáticamente los comportamientos bioquímicos de un gran panel de homólogos de AlkB. Fontimonas thermophila AlkB (FtAlkB), que comparte un 62 % de identidad de secuencia con el prototipo Pseudomonas oleovorans AlkB (GPo1AlkB, Fig. 1 complementaria), resultó prometedor en términos de rendimiento y estabilidad de proteínas (Fig. 2a complementaria). FtAlkB mostró actividades robustas de alcano hidroxilasa en un octano de alcano modelo (5 μmoles de producto/mg de proteína), que se compara favorablemente con el AlkB más activo que habíamos caracterizado previamente (4,5 μmoles de producto/mg de proteína para Alcanivorax borkumensis AlkB46) (Fig. 1b). Estos atributos marcaron a FtAlkB como un excelente candidato para estudios estructurales y mecánicos.

Dado que la actividad catalítica de AlkB depende del hierro, medimos el contenido de hierro de FtAlkB mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Nuestros resultados mostraron que el FtAlkB purificado está cargado de hierro, mientras que no detectamos ningún hierro por encima del fondo en una proteína de control. Además, no detectamos zinc por encima del nivel de fondo (Fig. 1c). Estos resultados muestran que FtAlkB se une específicamente al hierro. El contenido específico de hierro es de aproximadamente dos iones de hierro por molécula de proteína, de acuerdo con las observaciones estructurales que presentamos a continuación.

Para obtener información sobre los mecanismos moleculares de la reacción catalizada por AlkB, llevamos a cabo estudios crio-EM de una sola partícula en FtAlkB purificado en el detergente n-Dodecyl-β-d-Maltopyranoside (DDM, Fig. 3 complementaria y Tabla complementaria 1 ). Para superar el tamaño relativamente pequeño de la proteína (45 kD) y facilitar la alineación de partículas, desarrollamos un nanocuerpo que se une específicamente a FtAlkB y forma un complejo estable (Fig. 2b complementaria). Con la ayuda de un nanocuerpo como marcador fiduciario, obtuvimos reconstrucciones 3D de FtAlkB a una resolución de 3,45 Å (solo con máscara en FtAlkB; 3,59 Å con máscara en FtAlkB-nanocuerpo), y la resolución local de FtAlkB alcanza 2,8 Å a 3,2 Å. El mapa de alta calidad de FtAlkB nos permitió rastrear sin ambigüedades la proteína y construir un modelo (Fig. 1d, e y Fig. 4a complementaria).

La estructura FtAlkB consta de un dominio transmembrana (TMD) y un dominio catalítico. La regla del 'interior positivo'47 predice que los extremos N y C de FtAlkB deben residir en el lado intracelular de la membrana, colocando el dominio catalítico intracelularmente. Esto es consistente con la ubicación intracelular de los socios redox que supuestamente interactúan cerca del dominio catalítico. En el TMD, seis TM están dispuestos en forma de tienda de campaña con sus extremos citosólicos separados entre sí, creando una gran interfaz para acomodar el dominio catalítico (Fig. 1e). Además, las hélices H2 y H3 forman un bucle de reentrada que se inserta en la mitad de la membrana. En la interfase membrana-citosol, tres hélices paralelas a la superficie de la membrana ayudan a anclar el dominio citosólico a la membrana y posicionan los elementos estructurales para apoyar la formación del sitio activo. Los extremos citoplásmicos de TM4 y TM6 sobresalen de la membrana y proporcionan dos motivos ricos en histidina que coordinan los dos iones de hierro. El sitio de dihierro está encerrado además por dos segmentos citoplásmicos donde residen los otros dos motivos ricos en histidina: una hélice-giro-hélice entre TM4 y TM5, y un extremo C largo con hélices α cortas (Fig. 4g complementaria).

Según una búsqueda en el banco de datos de proteínas utilizando el servidor Dali48, FtAlkB no comparte una similitud estructural significativa con otras proteínas con estructuras experimentales. AlkB representa un pliegue que difiere sustancialmente de otras familias de proteínas conocidas, incluidas las de la superfamilia similar a FADS, como la desaturasa de ácidos grasos SCD1 y la esfingolípido α-hidroxilasa Scs7p (Fig. 4e-g complementaria).

En FtAlkB, dos iones de hierro están coordinados por nueve residuos de histidina de cuatro motivos ricos en histidina conservados (Fig. 2a y Fig. 1 complementaria). Un hierro está coordinado por cinco anillos de imidazol, mientras que el otro está unido por cuatro (Fig. 4b complementaria). Estos residuos de histidina son invariantes entre especies y se encontró que son indispensables para las funciones enzimáticas en GPo1AlkB39,49. La geometría de coordinación para ambos hierros exhibe algunas características de un arreglo octaédrico, con el otro hierro apareciendo a lo largo del eje donde falta un ligando; esto deja a los dos iones de hierro separados por ~5,4 Å. Nuestra estructura representa directamente un entorno rico en nitrógeno del centro de dihierro en AlkB. Esto corrobora la identidad de los ligandos metálicos conjeturados a partir de estudios espectroscópicos previos de AlkB50, y contrasta marcadamente con la coordinación rica en oxígeno que se encuentra en otras monooxigenasas de alcano dihierro no hemo conocidas. También observamos diferencias fundamentales en la configuración de los centros de dihierro entre AlkB y otras alcano monooxigenasas de dihierro, como sMMO. Primero, la distancia entre los dos iones en FtAlkB es mayor a ~5.4 Å en comparación con la distancia hierro-hierro de 3 Å en sMMO. En segundo lugar, no se observa ningún ligando puente para FtAlkB, mientras que sMMO tiene grupos carboxilato e hidróxido que unen dos iones de hierro. Estas diferencias clave indican que AlkB puede usar un mecanismo no informado previamente para la oxigenación de alcanos.

una estructura de FtAlkB con una vista de primer plano de la coordinación dihierro. Los residuos de histidina coordinados y un glutamato circundante se muestran en barras. b Alineaciones de motivos de histidina conservados. c Superposición de centros de dihierro en los miembros de la superfamilia tipo FADS.

Esta configuración dimetálica de AlkB está respaldada por observaciones en otras proteínas metabolizadoras de lípidos en la superfamilia similar a FADS, incluidas las desaturasas de ácidos grasos y las α-hidroxilasas de esfingolípidos. Aunque AlkB comparte una secuencia general limitada y una similitud estructural con ellos, los motivos ricos en histidina característicos de AlkB están organizados de manera similar en el espacio, y los residuos de histidina que coordinan el hierro forman un sitio de unión al dihierro que se asemeja a los de las desaturasas de ácidos grasos y las α-hidroxilasas de esfingolípidos (Fig. 2b, c). El espaciado variable entre los residuos de histidina se compensa con distintas conformaciones helicoidales. Estas observaciones sugieren un cierto grado de mecanismo catalítico compartido entre estos centros de dihierro ricos en nitrógeno.

Sin embargo, existen diferencias importantes: hay un grupo carboxilo de un residuo de glutamato conservado, E281, en AlkB que está cerca de Fe1 (el hierro coordinado por cuatro residuos de histidina) que podría interactuar potencialmente con ese hierro y los residuos de histidina cercanos, aunque el lado la cadena de E281 no está suficientemente resuelta en el mapa crio-EM. Por el contrario, una molécula de agua ocupa una posición similar en SCD1, mientras que Scs7p tiene una histidina adicional que forma una coordinación de cinco histidinas para ambos hierros (Fig. 2c). Estas diferencias en el entorno circundante de los hierros pueden afectar la reactividad de los hierros y la estabilidad de los intermedios de reacción, lo que puede desempeñar un papel en las distintas reacciones catalizadas por estas enzimas.

Comprender cómo los sustratos hidrofóbicos inertes alcanzan el sitio activo de AlkB es fundamental para dilucidar su capacidad de procesamiento de hidrocarburos. TM2, TM4 y TM6 forman un vestíbulo alargado que se extiende desde el dominio TM hacia el dominio catalítico y llega justo por encima del sitio activo. El vestíbulo está revestido principalmente por residuos hidrofóbicos y el diámetro del vestíbulo es compatible con la unión de alcanos (Fig. 3a). Curiosamente, encontramos una densidad tubular alargada sin proteínas que ocupa el vestíbulo (Fig. 3b y Fig. 4c complementaria). Un extremo de la densidad tubular está cerca del sitio activo y el extremo distal está cerca de W62. La forma de la densidad es compatible con una cadena de acilo, y los residuos hidrofóbicos circundantes podrían ayudar a acomodar un alcano. Colocamos tentativamente dodecano en la densidad en función de la coincidencia de longitud, aunque la identidad molecular de la densidad no se puede resolver sin ambigüedades en esta resolución. El extremo del alcano se coloca a una distancia similar a los dos hierros (~ 5,1 Å y ~ 5,7 Å, respectivamente; figura complementaria 4d).

a Una vista de corte del canal de sustrato de FtAlkB. Dos átomos de hierro se muestran como esferas de oliva. b Una vista de primer plano de la densidad del ligando equipada con dodecano. Los residuos de la cavidad clave se muestran en barras. c Actividades de hidroxilación de alcanos de mutantes FtAlkB en octano, normalizadas a tipo salvaje (media ± SEM; n = 3 experimentos independientes). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Entre los residuos del revestimiento del vestíbulo, tres residuos de leucina, L274, L315 y L318, están altamente conservados (Fig. 1 complementaria). L274 y L318 interactúan con el alcano cerca de su terminal (el sitio de oxidación) del lado opuesto. Estos dos residuos ayudan a posicionar el alcano adecuadamente para la reacción catalítica. L315, ubicado en la parte distal de la cavidad hidrófoba, también contacta con el alcano (Fig. 3b). Además, el motivo conservado L315X2L318 une una hélice hidrofóbica (H4) al último motivo rico en histidina (H321X2HH325). En nuestros estudios funcionales, la sustitución de triptófano por L274 o L318 abolió la actividad catalítica de FtAlkB (Fig. 3c). Por otro lado, la sustitución de L315W tuvo poco efecto sobre la actividad. Estos resultados resaltan la importancia del tamaño de la cadena lateral para L274 y L318, de acuerdo con su función propuesta en el posicionamiento del sustrato para el sitio activo. La región distal del canal del sustrato, donde se encuentra L315, puede adaptarse a una mayor variabilidad durante la catálisis.

En el vestíbulo del sustrato, W62 se encuentra en una posición estratégica, empacándose contra el último segmento del alcano. W62 y L141 (que interactúan con el extremo del alcano del otro lado) definen una porción estrecha del vestíbulo. Esta estrecha región puede presentar un obstáculo para acomodar alcanos con más de 12 carbonos. En particular, estudios previos mostraron que la posición equivalente de W62 en GPo1AlkB (W55) se correlaciona con la capacidad diferencial de las bacterias para crecer en alcanos: GPo1AlkB y sus homólogos cercanos con triptófano en esta posición pueden crecer en alcanos con 5 a 12 carbonos, con la longitud óptima de la cadena del alcano está cerca de 8. Por el contrario, los AlkB que poseen un pequeño residuo hidrofóbico (A, V, L o I) en la misma posición pueden metabolizar alcanos más largos, específicamente aquellos con al menos 12 carbonos44,49,51 . Estas observaciones son consistentes con un papel importante para W62.

Para probar aún más la hipótesis de que los residuos que restringen el canal del sustrato dictan la selectividad del sustrato, evaluamos la actividad de FtAlkB y su variante W62V en alcanos que van desde 5 a 14 carbonos (Fig. 4a, b y Fig. 5a complementaria). FtAlkB es activo en alcanos con 6–12 carbonos, con actividad óptima en heptano y octano. Para alcanos con >12 carbonos, no observamos actividad detectable. La variante W62V cambió claramente la selectividad del sustrato: mostró actividades relativas significativamente mayores para alcanos de cadena más larga como decano, undecano y dodecano. El mutante W62V también puede oxidar tridecano y tetradecano. Nuestros experimentos con GPo1AlkB mostraron una tendencia similar (Fig. 5b complementaria). Curiosamente, un estudio reciente de mutagénesis en D. cinnamea AlkB mostró que cambiar un aminoácido menos voluminoso en la posición equivalente a W62 de FtAlkB a uno más voluminoso (V91W) disminuyó las actividades en alcanos más largos52. Estos resultados subrayan el importante papel que juega el tamaño de la cadena lateral de esta posición en la determinación de la longitud de los sustratos óptimos.

a, b Actividades de hidroxilación de alcanos de WT (a) y W62V (b) en alcanos directos que van desde 5 a 14 carbonos (media ± SEM; n = 4 experimentos independientes para WT, n = 3 experimentos independientes para W62V). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Vías laterales potenciales para la entrada del sustrato o la liberación del producto. El dodecano se muestra en naranja. Los residuos clave se muestran en barras cian y las hélices cortas seleccionadas se muestran en rojo.

Todos estos resultados juntos son consistentes con un modelo en el que cada AlkB ha desarrollado un canal de sustrato que coincide estrechamente con el tamaño de sus alcanos objetivo, como un guante de noche largo que se ajusta firmemente a la mano y el brazo que se desliza en él.

Nuestra estructura de FtAlkB revela la arquitectura de esta familia de importantes enzimas. AlkB adopta un pliegue de proteína no observado previamente experimentalmente, al tiempo que comparte una geometría de coordinación de dimetal conservada general con desaturasas de ácidos grasos de membrana y α-hidroxilasas de esfingolípidos. El modelo AlphaFold53 (AF-A0A1I2KHB9-F1) se alinea bien con nuestra estructura FtAlkB (desviación cuadrática media raíz (rmsd) = 1,163 Å, figura complementaria 4e), lo que demuestra su capacidad para predecir un pliegue estructural desconocido. Por otro lado, la falta de iones metálicos en la estructura predicha de AlphaFold limita sus conocimientos catalíticos.

Nuestros estudios estructurales y funcionales brindan información importante sobre cómo AlkB logra la selectividad del sustrato. El grupo metilo terminal del sustrato se coloca cerca del sitio activo de dihierro. Un aminoácido voluminoso ~13 Å del sitio activo diferencia los AlkB que oxidan preferentemente alcanos de aproximadamente ocho carbonos de aquellos que oxidan eficientemente alcanos más largos (y concomitantemente oxidan menos eficientemente alcanos más cortos54), que tienen un residuo menos voluminoso en esa posición. Es concebible que el aminoácido voluminoso pueda servir como una barrera para los alcanos más largos y, al mismo tiempo, ayudar a mantener en su lugar los alcanos no polares de tamaño óptimo54. Potencialmente, otras características estructurales en el canal del sustrato podrían proporcionar una discriminación adicional. Por lo tanto, nuestra estructura proporciona una base para futuros esfuerzos para diseñar AlkB para aplicaciones biotecnológicas.

En nuestra estructura AlkB, TM2, que ancla el extremo distal del sustrato, no interactúa con los TM adyacentes en el lado citosólico, dejando aberturas laterales a la bicapa lipídica. Cada abertura está protegida por una hélice hidrofóbica paralela a la membrana, lo que sugiere una posible puerta que permite la entrada del sustrato o la liberación del producto (Fig. 4c). Esto sugiere que TM2 podría controlar una vía lateral que permite que los sustratos entren en el canal y los productos salgan de él. Tal puerta lateral permitiría que los alcanos que se dividen en la membrana alcancen el sitio activo a través de los canales de sustrato de AlkB de forma coincidente. De manera similar, después de la reacción, los productos alcohólicos se liberarían a través de la misma vía para que puedan oxidarse aún más a través del sistema de oxidación de ácidos grasos para proporcionar energía y una fuente de carbono a la bacteria.

La activación selectiva de enlaces CH es el santo grial de la química55. Por lo tanto, cómo los miembros de la superfamilia similar a FADS realizan la química de activación de CH ha sido durante mucho tiempo un tema de gran interés. Nuestra estructura proporciona información valiosa sobre este proceso. En nuestra estructura, AlkB posiciona el grupo metilo terminal cerca del sitio activo de dihierro. Para las desaturasas de ácidos grasos, los enlaces CC internos están posicionados para desaturarse. Estas observaciones juntas sugieren que los miembros de la superfamilia similar a FADS colocan sustratos de cadena alquílica larga en un canal de sustrato de tal manera que los enlaces que se romperán están adyacentes al sitio activo. Se cree que la catálisis crea un intermedio común de alta valencia que puede bifurcarse para desaturarse o hidroxilarse.

Nosotros y otros teníamos la hipótesis de que la superfamilia similar a FADS genera un intermedio catalíticamente competente que es similar al compuesto Q de la otra enzima activadora de dihierro CH bien caracterizada, sMMO54,56,57,58,59. Se pensó que dos iones de hierro de AlkB estarían conectados electrónicamente para proporcionar una ventaja energética al compartir los intermedios deficientes en electrones que se requieren para extraer un átomo de hidrógeno de un enlace CH fuerte. Inesperadamente, nuestra estructura muestra que el sitio activo rico en nitrógeno de AlkB tiene una gran distancia entre los dos iones de hierro y carece de un ligando puente. Esta configuración es fundamentalmente diferente del centro de dihierro no hemo rico en oxígeno de sMMO. En cambio, el sitio activo de AlkB se parece al de las desaturasas de ácidos grasos de membrana y las α-hidroxilasas de esfingolípidos (independientemente del hierro unido o del ion zinc incorporado incidentalmente en esas dos enzimas). Estas configuraciones de sitios activos comparables observadas de múltiples enzimas distintas en diferentes condiciones sugieren fuertemente que el centro de dihierro formado por residuos de histidina en la superfamilia similar a FADS difiere lo suficiente del de sMMO para requerir un intermedio catalítico distinto.

La estructura presentada aquí, combinada con el trabajo mecanicista previo de nuestro grupo, nos permite especular sobre el mecanismo de AlkB46,54,58,59,60,61 (Figura complementaria 6). La larga distancia observada entre los dos iones de hierro sugiere un mecanismo en el que los dos hierros desempeñan funciones diferentes, con un hierro que sirve como un relé de electrones y un sitio para la unión del agua, mientras que el otro ion de hierro sirve como sitio de catálisis. La transferencia de electrones acoplados a protones (PCET) de una especie de Fe(II)-OH2 en el hierro uno al segundo ion de hierro donde se une el O2 formaría una especie de peroxo férrico y una especie de hidróxido de hierro, que se protonarían fácilmente. La escisión heterolítica del enlace OO formaría una especie hidroxo férrica en un hierro, agua y el oxo Fe(V) catalíticamente competente en el otro hierro. Apoyando esta hipótesis está el hecho de que la otra metaloenzima con un tiempo de vida radical de sustrato comparablemente largo al de AlkB es la naftaleno dioxigenasa (NDO), donde se postula que una especie oxo formalmente Fe(V) es la especie activa62. Como se ha visto con las especies oxo de Mn(V), la estructura electrónica de las especies que rebotan (en el caso de AlkB, Fe(IV)-OH) impacta en el tiempo de vida del radical63. También es posible que pueda haber una reorganización sustancial del sitio activo durante la reacción, que no se ve en nuestra estructura, lo que podría conducir a un mecanismo de reacción más similar a sMMO64. La caracterización espectroscópica detallada de los intermedios de reacción será objeto de trabajos futuros.

El ADN que codifica FtAlkB (aminoácidos 4–399) se optimizó por codones y se clonó en el vector pRSF (Novagen). La proteína se sobreexpresó en E. coli BL21 (DE3). Las células se cultivaron a 37 °C y se indujeron con IPTG 0,2 mM en presencia de 10 mg/l de Fe3+ a 30 °C durante 5 h. Las células sedimentadas se resuspendieron en tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM) y se rompieron mediante sonicación. FtAlkB se solubilizó con DDM al 1 % (Anatrace) a 4 °C durante 1 hy luego se aisló del sobrenadante clarificado con resina de cobalto. Después de la digestión durante la noche con proteasa 3C, el eluyente FtAlkB se incubó con nanocuerpo AP32 en una proporción molar de 1:2. El complejo se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna de aumento Superdex 200 (GE Healthcare) en tampón que contenía HEPES 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y DDM al 0,02 % y se sometió a análisis crio-EM.

Las células que expresan AlkB se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de lisis y se abrieron mediante un solo paso de alta presión en la prensa francesa y luego se centrifugaron a 7000 × g durante 20 min. A 0,5 ml de sobrenadante celular se añadieron 0,5 ml de sobrenadante celular de células que expresaban AlkG y AlkT y 2 µl de sustrato purificado. La reacción se inició añadiendo suficiente NADH para lograr una concentración de trabajo de 12,3 mM. Los ensayos se incubaron mientras se agitaban a 37 °C durante 30 min. Al final del período de incubación, la reacción se inactivó con 100 μL de CHCl3. La mezcla se agitó durante 1 min y luego se centrifugó a 16 200 × g durante 5 min. La capa orgánica se transfirió y se inyectó en cromatografía de gases Agilent 7820 A con un detector selectivo de masas (MSD) Agilent 5977E. Se inyectó 1 μL de muestra en una columna Agilent HP-5 con una temperatura del inyector de 275 °C y una relación de división de 25:1. La temperatura inicial del horno fue de 45 °C, con un tiempo de mantenimiento de 2,25 min. Luego se aumentó la temperatura del horno a razón de 10 °C por minuto hasta una temperatura final de 225 °C. La identidad de cada compuesto se determinó comparando manualmente el patrón de fragmentación de cada pico con el de un estándar auténtico, inyectado en condiciones idénticas y eluido al mismo tiempo. Las intensidades de los picos se determinaron mediante la integración manual de la corriente iónica total (TIC) utilizando MSD ChemStation F.01.03.2357. Todos los ensayos de actividad incluyeron un control con sustrato + tampón y un control con AlkG, AlkT, NADH y sustrato. Las proteínas purificadas se analizaron de manera similar, excepto que se usaron AlkG purificada, ferredoxina reductasa de maíz y NADPH46,65.

Las proteínas purificadas se digirieron durante la noche en HNO3 al 50 % y luego se hirvieron durante 30 min. Las muestras se diluyeron con agua milli-Q hasta HNO3 al 5 % y se sometieron a un espectrómetro ICP-MS (Thermo Scientific XSERIES 2). Las proteínas AlkB y el control negativo, transportador semiSWEET que no contiene hierro, se prepararon en paralelo. Se utilizaron estándares de hierro para la calibración.

El nanocuerpo específico de FtAlkB se generó a partir de una biblioteca de nanocuerpos sintéticos siguiendo los protocolos publicados66,67. Después de tres ciclos de selección, se secuenció el candidato de nanocuerpo individual y se expresó en E. coli BL21 (DE3). Los nanocuerpos purificados se validaron por su capacidad de unión a FtAlkB mediante un ensayo desplegable y una SEC analítica. Nanobody AP32 fue identificado para formar un complejo estable con FtAlkB. El complejo se sometió a estudios crio-EM.

Para la preparación de la muestra, se incubaron 3 μL de FtAlkB concentrado (19 mg/ml) en rejillas de carbón perforado recién descargadas luminiscentes (Quantifoil Au R1.2/1.3 malla 300) durante 5 s, se secaron (tiempo 3, fuerza 3) y luego crioenfriado en etano líquido en un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) a 4 °C con una humedad del 100 %. Las redes se analizaron en un Titan Krios de 300 kV con detector Falcon 4 y filtro de energía Selectris (ancho de rendija 10 eV). Durante un tiempo de exposición de 8,14 s, el software EPU (Thermo Fisher Scientific) recopiló 50 fotogramas de película con un tamaño de píxel físico de 0,95 Å con un desenfoque de 1,6 μm a 2,2 μm y una dosis de exposición de electrones de 50 electrones por Å2.

MotionCorr268 corrigió el movimiento de un total de 5072 películas, lo que produjo imágenes ponderadas por dosis e imágenes sumadas. Las imágenes ponderadas por dosis se importaron y procesaron en cryoSPARC v3.369. La función de transferencia de contraste (CTF) de las imágenes se estimó mediante la estimación Patch CTF. Se seleccionaron imágenes con una resolución CTF superior a 8 Å, lo que produjo 4.965 imágenes. Se utilizó medio conjunto de datos para la selección automática mediante plantillas generadas a partir del selector de blobs. Después de la clasificación 2D, se usaron 51 617 partículas con diferentes vistas para el entrenamiento en Topaz v0.2.470. Posteriormente, se extrajeron 1 739 854 partículas totales con un tamaño de caja de 160 píxeles y binning 2 × 2 y se sometieron a clasificación 2D, refinamiento heterogéneo y reconstrucción Ab-Initio. El subconjunto bien definido de 242 089 partículas se volvió a extraer con un tamaño de cuadro de 224 píxeles y se refinó para generar un mapa de 4,47 Å con un refinamiento no uniforme con la configuración de resolución inicial de paso bajo de 12 Å, minimización sobre la escala por partícula habilitada y cinco pases finales extra. Para mejorar aún más la densidad, se realizó una clasificación 3D de múltiples referencias guiada por semillas71. Las multireferencias incluyen referencias precisas y sesgadas generadas por la reconstrucción de Ab-Initio, mapas de gradiente de resolución (mapa de 4,47 Å y otros dos mapas con resolución filtrada de paso bajo de 10 Å y 20 Å) y mapas de ruido ponderado (4,47 Å map y otros dos mapas en los que la micela se redujo en un factor de 0,3 y 0,7). Después de la reconstrucción de Ab-Initio y la eliminación de partículas duplicadas, se volvieron a extraer 253 772 partículas y se sometieron a un refinamiento heterogéneo con solo mapas ponderados de ruido, lo que resultó en 3,84 Å. Se combinaron las 145.869 partículas resultantes y las 242.089 partículas del procesamiento inicial. Los duplicados se eliminaron después de una ronda de refinamiento heterogéneo. Después de otras dos rondas de refinamiento heterogéneo, un total de 107 776 partículas produjeron un mapa de 3,72 Å. El mapa final se reconstruyó (FSC = 0,143) a 3,59 Å para el nanocuerpo FtAlkB o 3,45 Å para FtAlkB mediante refinamiento local y refinamiento CTF local. Este mapa fue agudizado respectivamente por DeepEMhancer72 para una mejor densidad de nanocuerpos y cryoSPARC para una mejor densidad de ligando. La resolución local fue calculada por BlocRes en cryoSRARC.

El modelo AlphaFold253 FtAlkB se ajustó a la densidad en Chimera y se reconstruyó manualmente en Coot73. Se ajustó un modelo de nanocuerpo de PDB 7SL8 en el mapa crio-EM y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se reconstruyeron manualmente con la ayuda de la predicción AlphaFold2. El modelo de nanocuerpo FtAlkB se refinó en Phenix74 y fue evaluado por MolProbity. Las estadísticas de refinamiento informadas en la Tabla complementaria 1 se basan en el mapa de punta de DeepEMhancer. Las figuras se prepararon utilizando PyMOL (Schrödinger, LLC)75, UCSF Chimera76 o ChimeraX77.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles a los autores correspondientes previa solicitud. El mapa de FtAlkB-nanobody se ha depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el código de acceso EMD-40303 (FtAlkB-nanobody). El modelo de nanocuerpo FtAlkB se encuentra en el Protein Data Bank (PDB) bajo 8SBB. Los modelos de estructura publicados anteriormente se descargaron de PDB utilizando los códigos de acceso 6WF2, 4ZR1, 7SL8 Datos de origen relacionados con las Figs. 1b, c, 3c, 4a, b y la Fig. 5b complementaria se proporcionan con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Gracias a Jacob Austin que ayudó a desarrollar el ensayo de actividad. Gracias a muchos estudiantes del grupo de Austin por las fructíferas discusiones sobre la estructura y función de AlkB durante los últimos 20 años. Gracias a Jamie Ross por su ayuda con la recopilación de datos ICP-MS. SW y JL recibieron becas Beckman. Un reconocimiento especial al profesor Jay T. Groves, cuyo trabajo de laboratorio sobre AlkB comenzó como parte de un centro financiado por NSF para Química Bioinorgánica Ambiental (CEBIC NSF9810248) y cuyo compromiso intelectual en este trabajo ha sido invaluable. Este trabajo fue posible gracias al apoyo de NIH R01 GM130989 (RNA & LF). Los fondos para comprar el ADN inicial utilizado en la pantalla a gran escala de AlkB provinieron de un Premio Presidencial de Investigación al ARN de Barnard College. Parte de este trabajo se realizó en el Stanford-SLAC Cryo-EM Center (S2C2) con el apoyo del programa NIH Common Fund Transformative High-Resolution Cryo-Electron Microscopy (U24 GM129541). El apoyo para el trabajo en el laboratorio de Austin también proviene de un generoso regalo de Roy y Diana Vagelos, que también agradecemos.

julieta lee

Dirección actual: Departamento de Bioquímica y Biofísica Molecular, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, 91125, EE. UU.

Shoshana C Williams

Dirección actual: Departamento de Química, Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

allison forsberg

Dirección actual: Departamento de Química, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, CA, 90007, EE. UU.

Estos autores contribuyeron por igual: Xue Guo, Jianxiu Zhang, Lei Han.

Departamento de Fisiología Molecular y Celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Xue Guo, Jianxiu Zhang, Lei Han, Yan Xu y Liang Feng

Departamento de Química, Barnard College, 3009 Broadway, Nueva York, NY, 10027, EE. UU.

Juliet Lee, Shoshana C. Williams, Allison Forsberg y Rachel Narehood Austin

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XG y JL realizaron la selección inicial y la verificación de candidatos. XG, LH y JZ llevaron a cabo estudios crio-EM. XG, LH e YX realizaron ICP-MS. JL, SW, AF y RNA realizaron estudios funcionales. RNA y LF dirigieron el proyecto. XG, RNA y LF escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Rachel Narehood Austin o Liang Feng.

Los autores declaran no tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Rhys Grinter y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Guo, X., Zhang, J., Han, L. et al. Estructura y mecanismo de la enzima oxidante de alcanos AlkB. Nat Comun 14, 2180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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Recibido: 23 de marzo de 2023

Aceptado: 03 abril 2023

Publicado: 17 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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