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Jul 24, 2023

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Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6394 (2023) Citar este artículo

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Con más de 20 medicamentos modificados con poli (etilenglicol) (PEG) aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en el mercado, el PEG es el polímero estándar de oro en bioconjugación. El acoplamiento mejora la estabilidad, la eficiencia y puede prolongar el tiempo de circulación sanguínea de las proteínas terapéuticas. Aunque la PEGilación se describe como no tóxica y no inmunogénica, se acumulan informes con datos que muestran reacciones alérgicas al PEG. Dado que el PEG no solo se aplica en la terapéutica, sino que también se puede encontrar en alimentos y cosméticos, los anticuerpos anti-PEG pueden aparecer incluso sin tratamiento médico. La hipersensibilidad al PEG puede conducir a una reducción de la eficacia del fármaco, una eliminación rápida de la sangre y, en casos raros, reacciones anafilácticas. Por lo tanto, encontrar alternativas para PEG es crucial. En este estudio, presentamos el poliglicerol lineal (LPG) para bioconjugación como polímero alternativo al PEG. Divulgamos la conjugación de LPG y PEG por clic-química a la glicoproteína eritropoyetina (EPO), sintetizada en un sistema de síntesis de proteínas sin células eucariotas. Además, se evaluó la influencia de los polímeros sobre la estabilidad y la actividad de las EPO en una línea celular dependiente de la hormona del crecimiento. Las características similares de ambos bioconjugados muestran que la LPGilación puede ser una alternativa prometedora a la PEGilación.

La EPO es conocida como la hormona que regula la producción de nuevos glóbulos rojos. La mayoría de las publicaciones recientes tratan de nuevos hallazgos sobre el mecanismo de acción de la EPO sobre la eritrocitosis1, el ictus isquémico2, la anemia3, la hipoxia4, la angiogénesis tumoral5 y las enfermedades neurodegenerativas6. En particular, llaman la atención las variantes de EPO modificadas genéticamente. Los agentes estimulantes de la eritropoyetina (ESA) se mejoraron continuamente, comenzando con la eritropoyetina alfa y beta hasta variantes con vidas medias más prolongadas, como la darbepoetina alfa7 y la EPO PEGilada (PEG-EPO8). Se sabe que PEG-EPO estimula la eritropoyesis de manera más efectiva en un intervalo de dosificación prolongado9. La EPO PEGilada (Mircera®) obtuvo la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en 2007 y se prescribe contra la anemia asociada con enfermedades renales10,11. Basado en el éxito de la EPO PEGilada y otros biofarmacéuticos, se espera que el mercado mundial de fármacos PEGilados alcance los 10.500 millones de dólares estadounidenses en 202412. Sin embargo, surge un problema esencial con los biofarmacéuticos PEGilados: los anticuerpos dirigidos a PEG. El PEG se considera un polímero biocompatible no tóxico y no inmunogénico que se une a más de 20 fármacos basados ​​en proteínas aprobados por la FDA13. Además, los tratamientos no proteicos, como las vacunas de ARNm, contienen nanopartículas PEGiladas14. Las proteínas, enzimas, péptidos y nanopartículas modificadas con PEG se caracterizan por una mayor solubilidad en agua y estabilidad proteolítica, lo que da como resultado una vida media prolongada15. Aunque se han realizado avances significativos, los sistemas PEGilados todavía tienen ciertas limitaciones que pueden restringir su uso generalizado. Estas limitaciones incluyen el desarrollo de anticuerpos anti-PEG tras el uso repetido de sustancias PEGiladas, reduciendo su eficacia terapéutica y, en casos específicos, reacciones alérgicas graves como la anafilaxia16. Un estudio de Yang et al. identificaron anticuerpos anti-PEG en el 72 % de las muestras contemporáneas mediante el uso de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas cuantitativo y competitivo17. Curiosamente, reconocieron que el 50% de las muestras de suero de las décadas de 1970 a 1990 también poseían anticuerpos anti-PEG. Debido a ensayos novedosos y más sensibles, la detección de anticuerpos anti-PEG y las reacciones inmunogénicas asociadas ocurren con mayor frecuencia. Además, el uso de productos de uso diario como cosméticos, jabones y medicamentos que también contienen PEG también podría afectar la presencia de anticuerpos anti-PEG preexistentes18,19. Por lo tanto, un replanteamiento del manejo de fármacos PEGilados es fundamental a partir de una detección fiable de anticuerpos anti-PEG y una adaptación precisa de las terapias con moléculas PEGiladas. Además, se han estudiado muchos polímeros naturales y sintéticos para reemplazar PEG para la extensión de la vida media20,21,22,23. En este contexto, el poliglicerol lineal (LPG) representa un candidato prometedor debido a su estructura y características similares a PEG24. Tanto el LPG como el PEG poseen un esqueleto de poliéter, aunque el LPG lleva un grupo hidroxilo en cada unidad repetitiva, lo que permite la introducción de fracciones de inmovilización, direccionamiento y etiquetado25,26. El GLP es altamente biocompatible y los ésteres de oligogliceroles con hasta 10 unidades repetitivas han sido aprobados por la FDA como aditivos alimentarios y farmacéuticos y han estado disponibles comercialmente durante algunas décadas27,28. Recientemente, el LPG se ha conjugado con éxito con varias proteínas modelo a través de diferentes químicas de conjugación, incluida la conjugación aleatoria con albúmina de suero bovino29, la conjugación específica del sitio mediante la cicloadición de azida-alquino (CuAAC) catalizada por cobre (I) con exenatida, la conjugación N-terminal con interleucina30 y Anakinra31 y conjugación específica del sitio mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC) a interferón-α-2a32,33.

Aunque el acoplamiento de PEG con diferentes pesos moleculares a la EPO se ha evaluado mucho en las últimas dos décadas, solo hay unos pocos informes que demuestran el uso de polímeros alternativos. Además, la cadena peptídica a menudo se modificaba, lo que resultaba en una eliminación de los sitios de glicosilación y la química de conjugación se limitaba al N- o al C-terminal34. Por ejemplo, un péptido mimético de la eritropoyetina se acopló a un hidroxietilalmidón biodegradable, lo que mejoró el efecto biológico35. A menudo, estos acoplamientos se basan en procesos químicos con condiciones adversas. En nuestro estudio, presentamos por primera vez una comparación de diferentes polímeros que se acoplaron mediante una reacción de clic biortogonal en condiciones suaves a una EPO con los tres sitios de N-glicosilación intactos. Además, utilizando la síntesis de proteínas libres de células, se sintetizaron diferentes conjugados de EPO en muy poco tiempo, lo que permitió el análisis de varias construcciones en paralelo. Por lo tanto, sintetizamos EPO PEGilada y LPGilada específica del sitio e investigamos su influencia en la actividad de la EPO en la línea celular TF-1 dependiente de la hormona del crecimiento. Hemos elegido la línea celular TF-1 debido a la presencia del receptor hEPO endógeno. Se sabe que esta línea celular prolifera en presencia de un factor de crecimiento hematopoyético activo, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), diferentes interleucinas y EPO. Comparamos estos bioconjugados de LPG y PEG con Mircera® comercializado y analizamos la estabilidad de la EPO individual en suero humano. Para este propósito, la EPO se sintetizó en un sistema libre de células como se informó previamente36. Los lisados ​​traduccionalmente activos contienen vesículas de membrana endógenas derivadas de ER, los llamados microsomas que permiten una translocación a la luz y la posterior modificación postraduccional, como glicosilación y puentes disulfuro37, ambos requisitos previos indispensables para la actividad de la EPO. Dado que no es posible la O-glicosilación en sistemas libres de células, se eligió esta posición para el acoplamiento de los polímeros de PEG y LPG. Por lo tanto, se introdujo un codón de terminación ámbar en la secuencia del gen. La adición de un ARNt supresor apropiado y una aminoacil-ARNt sintetasa diseñada a la reacción libre de células condujo a la incorporación de una p-azido-l-fenilalanina (AzF) en la cadena polipeptídica naciente36. El grupo azido se utilizó además para hacer clic en PEG y LPG modificados con ciclooctino a través de SPAAC, lo que resultó en EPO modificada específicamente para el sitio. Nuestro estudio muestra que los conjugados de EPO LPGilados muestran una actividad comparable a los equivalentes PEGilados en cultivos celulares y se mantuvieron estables durante más de 24 h.

Los disolventes anhidros (dimetilformamida y tolueno), los tubos de diálisis de celulosa benzoilada (2 kDa, 32 mm de ancho) se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). El bromuro de tetra-n-octilamonio al 98% se adquirió de ACROS Organics y se usó tal como se recibió. Todos los demás productos químicos se compraron a Merck (Darmstadt, Alemania) a menos que se indique lo contrario. Se usó α-metoxi-ω-amino-poli (etilenglicol) (PEG-NH2) de 10 kDa (Rapp POLYMERE, Tübingen, Alemania) tal como se recibió. Los espectros de RMN 1H se registraron en un Bruker AMX 500 (Bruker Corporation) o JEOL ECP 500 (JEOL GmbH). Los cambios químicos (δ) se informan en ppm a través del pico de disolvente deuterado como estándar. Las mediciones de IR se realizaron en un Nicolet AVATAR 320 FT_IR 5 SXC (Thermo Fisher Scientific) con un rango de detector de 4000–650/cm. Las mediciones de cromatografía de permeación en gel (GPC) en agua se realizaron con un Agilent 1100 equipado con un inyector automático, una bomba isotérmica y un refractómetro diferencial Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La columna PSS Suprema (precolumna), 1 × con un tamaño de poro de 30 Å, 2 × con un tamaño de poro de 1000 Å (todas ellas con un tamaño de partícula de 10 μm), se calibró frente a los estándares de Pullulan antes de las mediciones. Las mediciones de GPC en tetrahidrofurano (THF) se realizaron con un Agilent SECurity (Serie 1200), equipado con un inyector automático, isopump y detector UV y RI. La separación se realizó mediante un gel de fotoluminiscencia de Agilent (1 × precolumna, 3 × Mixed-C con un tamaño de partícula de 5 μm), que se calibró contra estándares de poliestireno.

La protección con acetal del glicidol, su polimerización y la modificación de los extremos de la cadena se realizaron en base a los procedimientos informados previamente por nosotros32. En resumen, en un matraz Schlenck secado a la llama (Oct) se secó 4NBr (268 mg, 0,480 mmol, 0,008 eq) en atmósfera de argón. A continuación, se disolvió en 60 ml de tolueno seco a TA antes de la adición de etoxietil glicidil éter (EEGE) (10 ml, 65,6 mmol, 1 eq). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió rápidamente i-Bu3Al (2,1 ml, 2,4 mmol, 0,036 eq) con agitación a alta velocidad. Se dejó que la reacción transcurriera durante la noche a temperatura ambiente y se inactivó mediante la adición de 1 ml de etanol. El producto bruto se purificó por diálisis frente a acetona (MWCO: 2000 g/mol). El producto se obtuvo como un aceite de color amarillo claro (GPC en THF: Mn: 20687, Đ: 1,12). Para la eliminación de los grupos acetal, el polímero se disolvió en etanol (0,1 g/mL) y HCl (3% v/v de etanol) durante al menos dos horas antes de la diálisis en agua (MWCO: 1000 g/mol). El producto se obtuvo como un aceite incoloro (GPC agua: Mn: 11885, Đ: 1,19). A continuación, se disolvió el polímero desprotegido (1 g, 0,08 mmol, 1 eq) en 5 ml de DMF seca y se calentó a 80 °C a reflujo antes de añadir NaN3 (30 mg, 0,4 mmol, 5 eq) a la mezcla. La reacción transcurrió a esta temperatura durante 3 días y se purificó mediante diálisis en agua (MWCO: 1000 g/mol). La modificación exitosa se observó mediante espectroscopia IR (2100/cm de pico de azida). El grupo azida se redujo a amina disolviendo LPG-N3 (1 eq) en agua (0,05 g/ml). Posteriormente, se añadió a la solución TCEP (1,5 eq a grupos N3). La reacción fue monitoreada por espectroscopía IR hasta que desapareció la respectiva banda de N3. Posteriormente, la purificación se realizó por diálisis en agua (MWCO: 1000 g/mol). Luego se disolvió LPG-NH2 (1 eq) en DMF seca (32 mg/ml), luego se añadieron a la mezcla Et3N (3 eq) y BCN-NHS (1,5 eq). La reacción se agitó durante la noche y se purificó mediante diálisis frente a agua (MWCO: 1000 g/mol). Como el BCN modificado con LPG es propenso a entrecruzarse en estado seco, se asume la conversión completa en esta etapa. La calidad de LPG-BCN se controló mediante el espectro 1HNMR (Fig. 1 complementaria). Según la medición de GPC en agua, el GLP tiene un MW de 11,8 kDa.

La modificación del PEG-NH2 comercial se realizó según el procedimiento descrito anteriormente para el LPG-NH2. La calidad de PEG-BCN se controló mediante el espectro 1HNMR (Fig. 2 complementaria). Basado en la medición de GPC en agua, el PEG tiene un MW de 10 kDa.

La secuencia del gen que codifica la secuencia de la eritropoyetina (Uniprot P01588) se modificó para la síntesis de proteínas libres de células y la supresión del ámbar. Por lo tanto, la plantilla de ADN se cambió como se informó previamente38. Además, la secuencia de señal nativa se reemplazó por una secuencia de señal de melitina (aaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcgtatacatttcttacatctatgcggac). Se diseñó una segunda construcción intercambiando el codón 153 (sitio de O-glicosilación) por un codón de terminación ámbar. Las secuencias se fabricaron mediante síntesis de novo (Biocat GmbH, Alemania) y se ligaron en el esqueleto del vector pUC57-1.8 k.

La aminoacil-tRNA sintetasa modificada por ingeniería genética (eAzFRS) y el supresor de tRNA se fabricaron como se describe en detalle en Zemella et al. 201939. En resumen, la aminoacil-tRNA sintetasa se sintetizó en el "RTS500 ProteoMaster E. coli HY Kit" (Biotechrabbit GmbH, Alemania), se purificó mediante Strep-Tag, se concentró y se almacenó a -80 °C en un tampón de almacenamiento de sintetasa (50 HEPES mM, KOAc 10 mM, MgCl2 1 mM, DTT 4 mM, NaN3 al 0,02 %, pH 7,6).

El ADN molde para el ARNt supresor se generó mediante una reacción de PCR con un par de cebadores O-metilo específico, seguida de una transcripción final. El ARNt se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo utilizando el reactivo TRIzol (ThermoFisher Scientific), se precipitó con isopropanol y se resuspendió en agua ultrapura. El ARNt se plegó en un ciclador de PCR (Biometra TRIO, Analytik Jena) y se almacenó a -80 °C.

La síntesis de proteínas libres de células se basó en lisados ​​traduccionalmente activos derivados de células cultivadas de Spodoptera frugiperda 21 (Sf21). La preparación del lisado se realizó como se describió anteriormente40,41. Se añadió molde de ADN (60 ng/µL) a una mezcla de reacción compuesta por lisado al 20 % (v/v), aminoácidos 100 µM, sales, componentes energéticos y PolyG (10 µM, biomers, Alemania). Un protocolo detallado de la reacción se describe en 38,42. Para controlar el rendimiento de proteína mediante recuento de centelleo y la integridad de proteína mediante SDS-PAGE seguido de autorradiografía, se complementó la reacción con 14C-leucina marcada radiactivamente uniformemente (fc 30 µM, Perkin Elmer, Alemania). La leucina 14C se incorpora estadísticamente a la proteína sintetizada de novo. Para la incorporación del aminoácido no canónico se añadieron p-azido-l-fenilalanina 2 mM, eAzFRS 3 µM y ARNt supresor 5 µM. La integración exitosa fue monitoreada por autorradiografía. En detalle, se realizó una reacción de transcripción-traducción acoplada usando el plásmido que contenía un codón de terminación ámbar en presencia y ausencia de la sintetasa ortogonal eAzFRS. La reacción de síntesis en ausencia de eAzFRS da como resultado un patrón de bandas que corresponde a la EPO truncada en el aminoácido 153. Esta EPO truncada aún posee las tres N-glicosilaciones. La reacción de síntesis en presencia de eAzFRS da como resultado un patrón de bandas que corresponde a la EPO de longitud completa con tres N-glicosilaciones. Una diferencia en el patrón de bandas, en particular un cambio en el peso molecular aparente de la EPO en presencia de la sintetasa, verifica la incorporación de AzF. Además, la incorporación de AzF se mostró previamente mediante el acoplamiento específico de un colorante de fosfina reactivo con azida a EPO36.

Las reacciones se incubaron durante 3 h a 27 °C, 500 rpm, cubiertas por una lámina de aluminio.

Dado que la EPO se traslada a la luz de las vesículas microsomales, la proteína tuvo que ser liberada. Por lo tanto, los microsomas se centrifugaron a 16 000 × g durante 10 min a 4 °C y el sedimento se resuspendió en PBS con el detergente n-Dodecyl-β-Maltoside (0,2 % DDM, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, EE. UU.) , se agitó durante 45 min a 1000 rpm y se volvió a centrifugar. El sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf vacío y se usó para el acoplamiento de polímeros de PEG y LPG y para análisis de estabilidad, así como ensayos de cultivo celular.

Los polímeros se disolvieron en agua a una concentración de stock de 5 a 10 mM. Se incubaron 10 ng de EPO producida sin células con BCN-PEG y BCN-LPG 5 mM en un tubo Eppendorf durante la noche a 4 °C. El acoplamiento de los polímeros se controló mediante un cambio de EPO en autorradiografía.

Las N-glicosilaciones de EPO modificada y no modificada fueron escindidas por PNGase F (NEB, EE. UU.). El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El rendimiento de proteína de la EPO sintetizada libre de células se determinó mediante precipitación con ácido tricloroacético caliente (TCA, Carl Roth GmbH, Alemania) seguida de recuento por centelleo líquido43.

Las muestras de EPO se precipitaron en acetona fría, se secaron y se volvieron a solubilizar en tampón de muestra LDS (tampón de muestra NuPAGE LDS, Thermo Fisher Scientific). Las muestras se cargaron en geles SDS-PAGE prefabricados (NuPAGE, 10 % Bis-Tris, Thermo Fisher Scientific) y se separaron durante 40 min a 180 V. Los geles se lavaron con agua, se tiñeron simplemente con azul seguro (Thermo Fisher Scientific) y se lavaron. de nuevo. Posteriormente, los geles se secaron durante 60 min a 70 °C (Unigeldryer 3545D, Alemania). Los geles se expusieron a pantallas de fósforo durante 48 h. Las bandas se visualizaron mediante imágenes de fósforo (Amersham Typhoon RGB, GE Healthcare).

Se cultivaron células TF-1 (Leibnitz-Institut DSMZ, Alemania, DSMZ-No. ACC-334) que expresan el receptor hEPO en RPMI-1640 al 85 % (PAN Biotech), FCS al 13 % (Biochrom), piruvato de sodio al 1 % (Biowest ), penicilina-estreptomicina al 1% (PAN Biotech) y 5 ng/mL de GM-CSF (PeproTech, Alemania). Las células se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % en matraces T25 y T75 en una incubadora de CO2 (Binder, Alemania). La densidad celular se mantuvo entre 2 y 7 × 105 células/mL. Para el ensayo de actividad, se transfirieron 2,0 × 105 células a medio fresco sin GM-CSF. Cada variante de EPO (EPO recombinante sintetizada sin células (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, EE. UU., #E5546-50 UG), Mircera® (Roche, Basilea, Suiza, 0,3 ml)) y GM-CSF se agregaron con una concentración final de 10 ng/mL. Se añadió un volumen igual de un control sin plantilla (NTC) como control negativo. El crecimiento celular se controló durante una semana mediante tinción con azul de tripano en una cámara de recuento Luna (Logos biosystems). El ensayo se realizó por triplicado y para cada muestra se realizaron dos mediciones, lo que resultó en seis alícuotas contadas para cada muestra.

La EPO se sintetizó como se describe anteriormente y se acopló a PEG y LPG. La EPO modificada y no modificada se incubó con suero humano (SeraCon II, HiSS Diagnostics, Alemania) durante un máximo de 24 h. Después de 0, 2, 4, 8 y 24 h se tomó una alícuota y se congeló inmediatamente con nitrógeno líquido. Las alícuotas se precipitaron en acetona y se cargaron en un SDS-PAGE. La integridad de las bandas de proteínas se analizó mediante autorradiografía.

En la figura 1 se observa un esquema general de la síntesis y la modificación del extremo de la cadena de LPG y PEG con el siguiente acoplamiento a la EPO sintetizada libre de células.

Esquema general de la síntesis y modificación de extremos de cadena de LPG y PEG con el siguiente acoplamiento a EPO sintetizada libre de células. Estructura EPO obtenida de la entrada PDB 1BUY44.

La síntesis de proteínas libres de células de EPO dio como resultado un patrón de bandas distinto con cuatro bandas definidas (Fig. 2A). Estas bandas corresponden a las tres N-glicosilaciones de la EPO (glicosilada en uno, dos o tres sitios) y la forma no glicosilada de la EPO. La O-glicosilación adicional de EPO no se aborda durante la síntesis de proteínas libres de células. Por lo tanto, el aminoácido no canónico se colocó en la posición de la O-glicosilación. La introducción del aminoácido no canónico p-azido-l-fenilalanina (AzF) en la posición de O-glicosilación no alteró el patrón de glicosilación de EPO (azido-EPO, carril 3). La glicodigestión con PNGasa F para ambas muestras dio como resultado una banda más baja en el peso molecular esperado de EPO no glicosilada (carriles 2 y 4). Sin sintetasa ortogonal aplicada durante la síntesis libre de células, no se visualizó EPO de longitud completa en la autorradiografía (carril 5). Además, se detectó el producto de terminación glicosilado. Después de la incubación con PNGasa F, solo se detectó el producto de terminación desglicosilado (carril 6).

Acoplamiento quimioselectivo de eritropoyetina con LPG-BCN y PEG-BCN. (A) Autorradiografía de diferentes variantes de EPO: carril 1 y 2 EPO de longitud completa sin aminoácido no canónico, producto de supresión de carril 3 y 4 con p-azido-L-fenilalanina incorporado, producto de terminación de carril 5 y 6 terminado en el ámbar codón de parada. Cada variante se analizó en ausencia (carriles 1, 3, 5) y presencia (carriles 2, 4, 6) de glucosidasa PNGasa F. La incorporación exitosa de AzF condujo a un patrón de bandas comparable al observado para la EPO de longitud completa sin aminoácido canónico. La síntesis de EPO (con codón de parada ámbar) en ausencia de eAzFRS condujo a un patrón de bandas con un peso molecular reducido como se esperaba para el producto truncado. (B) Autorradiografía después del acoplamiento de LPG-BCN y PEG-BCN a EPO. Los carriles 1–4 y 9 muestran el acoplamiento de LPG-BCN a AzF que contiene EPO (carriles 1–2), EPO terminado (carriles 3–4) y EPO completo (carriles 9) en ausencia (carriles 1 y 3) y presencia (carriles 2, 4, 9) de PNGasa F. El acoplamiento exitoso de LPG-BCN a EPO que contiene AzF se ve por un cambio de las bandas correspondientes de EPO a un peso molecular más alto (carriles 1 y 2) en alrededor de 50–60 kDa. Los carriles 5–8 y 10 muestran el acoplamiento de PEG-BCN a AzF que contiene EPO (carriles 5–6), EPO terminado (carriles 7–8) y EPO de longitud completa (carriles 10) en ausencia (carriles 5 y 7) y presencia (carriles 6, 8, 10) de PNGasa F. El acoplamiento exitoso de PEG-BCN a EPO que contiene AzF se ve por un cambio de las bandas correspondientes de EPO a un peso molecular más alto (carriles 5 y 6) en alrededor de 40–48 kDa. Las imágenes de autorradiografía sin recortar se incluyen en Información complementaria.

Dado que la incorporación de AzF se verificó en un primer paso, se incubó azido-EPO con PEG y LPG modificados con BCN para obtener el bioconjugado específico del sitio (Fig. 2B). La incubación de azido-EPO con LPG-BCN dio como resultado un patrón de bandas más débil en el peso molecular esperado para EPO desacoplada. Son visibles frotis y bandas adicionales de mayor peso molecular, lo que indica un acoplamiento exitoso del polímero (Fig. 2B, carril 1). Esta suposición se verifica mediante la incubación de LPG-BCN con la EPO truncada resultante de la terminación en el codón de parada ámbar. Aquí no eran visibles bandas adicionales por encima del producto de terminación para LPG-BCN (carril 3). La glicodigestión de LPG-EPO dio como resultado un cambio del frotis a un peso molecular más bajo, lo que indica que la EPO glicosilada se acopló con éxito a LPG-BCN (carril 2).

Se obtuvo un resultado similar para la incubación de azido-EPO con PEG-BCN. Aquí son visibles bandas definidas a un peso molecular más alto, verificando el acoplamiento de PEG-BCN a azido-EPO (carril 5). Nuevamente, después de la digestión con PNGasa F, la banda prominente cambió a un peso molecular aparente más bajo, lo que indica que la azido-EPO glicosilada se acopló con éxito a PEG-BCN (carril 6). A diferencia de LPG-BCN, se detecta mediante autorradiografía (carril 7) un acoplamiento ligeramente inespecífico con el producto de terminación de PEG-BCN. Esto es incluso más visible mediante la incubación de EPO desglicosilada (sin grupo azido) con los polímeros (carriles 4 y 8). Aquí no se espera acoplamiento ya que no hay AzF presente en el EPO traducido. Por lo tanto, en la autorradiografía debería verse un patrón de bandas comparable al de la pista 5 de la Fig. 1. De hecho, el mismo patrón de bandas es visible en presencia de GLP. Por el contrario, una ligera banda adicional en presencia de PEG es una indicación visible de una ligera unión inespecífica de PEG a la EPO truncada. También se detectó un acoplamiento inespecífico comparable de PEG-BCN con EPO de longitud completa sin AzF incorporado (carril 10). No se observó acoplamiento inespecífico de LPG-BCN a EPO de longitud completa sin AzF incorporado (carril 9). Los controles adicionales revelaron los resultados esperados (Fig. 3 complementaria) que confirman la integración de AzF y el posterior acoplamiento de cada polímero. Sin embargo, se obtuvo una mezcla de EPO acoplada a LPG y EPO no acoplada para el análisis del cultivo celular. Según la autorradiografía, alrededor del 50-70 % de la muestra contiene EPO acoplada con LPG, mientras que el 30-50 % restante está compuesta por EPO no acoplada. Dado que el acoplamiento de PEG a EPO dio como resultado una eficiencia de casi el 100 %, estimamos que el porcentaje de EPO acoplado a PEG para ensayos de cultivo celular es de alrededor del 90 %. El 10% restante está compuesto por EPO no acoplada y PEG-EPO acoplada inespecífica.

Para la determinación de la actividad de las variantes de EPO individuales, se cultivó una línea celular dependiente de la hormona del crecimiento (células TF-1) en presencia y ausencia de EPO modificada y no modificada (Figs. 3 y 4). El ensayo de actividad mostró que todas las muestras que contenían EPO dieron como resultado un crecimiento de células comparable al de la EPO disponible en el mercado. El efecto más alto se observó después de la adición de PEG-EPO (Fig. 3). El efecto fue aún mayor en comparación con la EPO no modificada y la EPO PEGilada disponible en el mercado (Mircera®). Como era de esperar, los controles (sin control de plantilla y producto de terminación) no mostraron actividad o solo mostraron actividad limitada (producto de terminación). Curiosamente, la EPO modificada con PEG y la EPO no modificada mostraron curvas de crecimiento casi comparables hasta el día 4. La curva de crecimiento de la EPO no modificada alcanzó su máximo después de 4 días, mientras que el pico de la EPO modificada con PEG se calculó después de 5 días. Además, las células incubadas con EPO modificada con PEG mostraron una curva de crecimiento prolongada.

Ensayo de actividad basado en células de EPO sintetizada libre de células modificada y no modificada con PEG. Curvas de crecimiento de la línea celular TF-1 suplementada con EPO modificada con PEG (línea continua), EPO no modificada (línea discontinua), producto de terminación (línea discontinua de un solo punto) control sin plantilla sin células (NTC, línea discontinua) línea de puntos dobles), EPO comercial (línea discontinua) y Mircera® comercial (línea discontinua gris). Las concentraciones de variantes de EPO sintetizadas sin células se determinaron mediante precipitación con TCA. Se añadieron 10 ng/ml de cada muestra a las células TF-1 cultivadas en una placa de 24 pocillos. Las células se contaron durante 6 días. Los datos se presentan como la desviación estándar de tres experimentos independientes medidos por duplicado (n = 3).

Ensayo de actividad basado en células de EPO sintetizada libre de células modificada y no modificada con LPG. Curvas de crecimiento de la línea celular TF-1 suplementada con EPO modificada con LPG (línea continua), EPO no modificada (línea discontinua), producto de terminación (línea discontinua de un solo punto) control sin plantilla sin células (NTC, línea discontinua) línea de puntos dobles), EPO comercial (línea discontinua) y Mircera® comercial (línea discontinua gris). Las concentraciones de variantes de EPO sintetizadas sin células se determinaron mediante precipitación con TCA. Se añadieron 10 ng/ml de cada muestra a las células TF-1 cultivadas en una placa de 24 pocillos. Las células se contaron durante 6 días. Los datos se presentan como la desviación estándar de tres experimentos independientes medidos por duplicado (n = 3).

Se observó un efecto comparable después de la adición de LPG-EPO y los controles correspondientes (Fig. 4). La tasa de crecimiento más alta se determinó después de la adición de EPO comercial, lo que resultó en una densidad celular máxima de 7 × 105 células/mL. Una vez más, el efecto de LPG-EPO con una densidad celular máxima de 6,2 × 105 células/ml fue comparable al de la EPO comercial. Sorprendentemente, el máximo de células contadas después de la adición de LPG-EPO estuvo de acuerdo con PEG-EPO en los días 4 y 5. El efecto de LPG-EPO fue aún mayor en comparación con la adición de PEG-EPO. Una vez más, la adición de EPO no modificada sintetizada sin células dio como resultado una densidad celular máxima en el día 4 con 5,5 × 105 células/mL.

Se detectaron los resultados esperados para los controles: las células mueren rápidamente en presencia del producto de terminación y NTC. Los controles adicionales no revelaron ningún efecto de los polímeros en el cultivo celular (Fig. 4 complementaria).

El efecto del LPG y el PEG conjugados sobre la estabilidad de la EPO se analizó adicionalmente mediante una prueba de estabilidad en suero (Fig. 5). Las variantes de EPO modificadas y no modificadas se incubaron durante 24 h en suero humano. Las muestras se recogieron en puntos de tiempo predeterminados. La integridad de la proteína se analizó mediante autorradiografía. La EPO no modificada (de longitud completa y con aminoácidos no canónicos) mostró el patrón de bandas característico que consiste en EPO no glicosilada y EPO adicional que está glicosilada en hasta tres sitios. PEG-EPO mostró solo una banda de mayor peso molecular que la EPO, correspondiente a la proteína acoplada a polímero. No se detectó proteína desacoplada. LPG-EPO mostró nuevamente una mancha por encima de la banda de PEG-EPO. Son visibles bandas ligeras para la EPO desacoplada. La conjugación de PEG y LPG no mostró una influencia significativa en la estabilidad del suero de EPO, ya que todos los bioconjugados mostraron un patrón de bandas comparable incluso después de 24 h de incubación en suero humano.

Análisis de estabilidad de EPO modificada y no modificada. La EPO de longitud completa no modificada, la EPO no modificada que contiene un aminoácido no canónico (ncaa), la EPO modificada con PEG y modificada con LPG se incubaron hasta 24 h en suero humano. Posteriormente, las muestras se precipitaron con acetona y se analizaron mediante SDS-PAGE con la siguiente autorradiografía. No se observaron cambios en el patrón de bandas después de 24 h, lo que indica muestras de EPO estables. Las imágenes de autorradiografía sin recortar se incluyen en Información complementaria.

El poli (etilenglicol) (PEG) ha sido el "estándar de oro" para mejorar las características de las proteínas, como la estabilidad, la solubilidad y la inmunogenicidad. Durante los últimos 30 años se fabricó una amplia gama de diferentes estructuras de PEG, desde pesos moleculares pequeños (550 Da) hasta polímeros lineales y ramificados grandes (> 8 000 000 Da)45. Mientras que en 1992 solo se detectaron siete estructuras de PEG diferentes en productos cosméticos46, este número aumentó a más de 340 estructuras de PEG diferentes en 201547. El uso frecuente de PEG también está relacionado con el comportamiento inerte y no inmunogénico del PEG. Sin embargo, informes recientes muestran que los anticuerpos anti-PEG pueden aparecer después de la inyección de liposomas y proteínas PEGiladas48,49 y después del contacto con productos cosméticos que contienen PEG. En particular, múltiples cadenas cortas de PEG (< 10 kDa) unidas a proteínas tienen una mayor probabilidad de inducir anticuerpos anti-PEG50,51. Un estudio reciente ha analizado el impacto de los anticuerpos anti-PEG IgM e IgG preexistentes sobre la eficacia terapéutica de la EPO52 PEGilada. Para ello, se estableció un modelo de ratón con anticuerpos monoclonales anti-PEG preinyectados antes de la administración de PEG-EPO. Como resultado, la capacidad de PEG-EPO para inducir la producción de nuevos glóbulos rojos fue bloqueada por anticuerpos anti-PEG debido a la acumulación de PEG-EPO en el hígado y el bazo. La actividad biológica de PEG-EPO se recuperó aumentando la concentración inicial. Por lo tanto, la dosis adecuada de PEG-EPO debe evaluarse en función de la medición de anticuerpos anti-PEG preexistentes en pacientes individuales. Alternativamente, las biomoléculas novedosas que tienen una función similar a la del PEG podrían sortear los problemas actuales con los anticuerpos anti-PEG.

Mientras tanto, polímeros sintéticos alternativos como poli(gliceroles), poli(oxazolinas), poli(metacrilato de hidroxipropilo), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida), poli(vinilpirrolidona), poli(N ,N-dimetilacrilamida) y poli(N-acriloilmorfolina) se han estudiado para reemplazar a PEG53,54. Cada uno de los polímeros muestra ventajas únicas como la no inmunogenicidad, alta hidrofilia, buena biocompatibilidad, pero también desventajas como la acumulación, la no biodegradabilidad y costos de síntesis parcialmente altos55. Por lo tanto, los polímeros deben evaluarse en detalle para obtener información sobre las características de la proteína individual y su posible impacto en el cuerpo humano.

Debido a las características estructurales del poliglicerol lineal (LPG), propone un candidato prometedor para la conjugación a proteínas. En un estudio que comparó los liposomas PEG y LPGilados, Abu Lila et al. observó que, a diferencia de los liposomas pegilados, la modificación con LPG mejora el rendimiento in vivo del sistema. Los liposomas LPGilados no indujeron un aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC), una limitación de los liposomas PEGilados tras la administración repetida, que puede influir negativamente en la actividad farmacéutica56.

Imran Ul-haq et al. compararon PEG y LPG en entornos in vitro e in vivo. Demostraron que el GLP tiene una viscosidad intrínseca 25 veces menor que el PEG cuando se comparan moléculas del mismo tamaño. Esta característica es de gran importancia en formulaciones donde se requieren concentraciones más altas. Además, los estudios basados ​​en la agregación de glóbulos rojos (RBC) y los ensayos de hemólisis observaron que el LPG no indujo ninguna agregación de RBC incluso a concentraciones de 10 mg/mL, mientras que el PEG indujo una agregación masiva de RBC a esta concentración57. Esto también se ha observado antes para PEG y LPG58 de menor peso molecular.

La síntesis de proteínas sin células se eligió para analizar las características fundamentales de los polímeros basados ​​en PEG y LPG, como el impacto en la estabilidad e integridad de las proteínas, así como la influencia en las células humanas cultivadas. La síntesis y modificación exitosas de EPO en sistemas de síntesis de proteínas libres de células se mostró previamente36. A diferencia del estudio de 2018, ahora hemos analizado el efecto de los polímeros acoplados en las características de las EPO. Curiosamente, ambos polímeros mostraron comportamientos diferentes después del proceso de acoplamiento. Después de la conjugación de los polímeros, fue visible en la SDS-PAGE un cambio prominente hacia un peso molecular más alto. De hecho, la migración del gel se veía diferente entre ambos polímeros a pesar de que LPG-BCN y PEG-BCN tienen un peso molecular similar de 10 kDa. Este efecto puede explicarse por interacciones específicas de los polímeros dentro de SDS-PAGE como se describió anteriormente para PEG59. Además, también se observó un efecto comparable después del acoplamiento de LPG-BCN y PEG-BCN con la interleucina-431 humana. Además de la migración del gel modificada, la bioconjugación de LPG y PEG mostró una eficiencia de acoplamiento diferente. Para PEG-BCN se estima una eficiencia de acoplamiento del 90-95% y para LPG-BCN una eficiencia de acoplamiento del 50%. Estas diferencias pueden ocurrir debido a perfiles específicos de interacción proteína-polímero. En el caso de PEG-BCN se describen lisinas y argininas cargadas positivamente, mientras que el LPG se encuentra muy próximo a serinas y metioninas32. La proporción de lisinas y argininas es mucho mayor en EPO en comparación con metioninas y serinas. Independientemente, la eficiencia de acoplamiento fue suficiente para ambos polímeros, lo que condujo a una señal específica determinada por autorradiografía. En consecuencia, se determinó el efecto de la EPO no modificada y modificada en el cultivo celular. Las curvas de crecimiento mostraron los resultados esperados ya que las células solo crecieron en presencia de variantes de EPO. No obstante, las diferencias entre las variantes de EPO eran visibles. Dentro de los primeros tres días, el crecimiento de las células tras la estimulación con PEG- y LPG-EPO no modificado y fue casi idéntico. Después del día 4, el crecimiento de las células incubadas con EPO no modificada se detuvo, mientras que las células incubadas con ambas EPO modificadas siguieron creciendo. Esto indica una actividad prolongada de la EPO modificada con polímeros. Estos hallazgos están de acuerdo con los efectos positivos descritos de las variantes de EPO conjugadas con polímeros7,8.

Los datos obtenidos del ensayo de estabilidad también están de acuerdo con hallazgos anteriores. Un estudio anterior recolectó muestras de suero y plasma que contenían EPO y almacenó estas muestras durante 14 días en diferentes condiciones. Incluso la muestra almacenada a temperatura ambiente contenía EPO inmunorreactiva después de 14 días60.

Dado que la síntesis de proteínas libres de células se puede realizar en una escala de µL a litro y la síntesis de proteínas farmacéuticamente relevantes, como la EPO, generalmente se realiza en unas pocas horas, el sistema ofrece una excelente opción para la detección de alternativas de PEG acopladas en pre- posiciones definidas en la EPO humana.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

Polietilenglicol)

poliglicerol lineal

eritropoyetina

Cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre

Cicloadición de azida-alquino promovida por cepas

Biciclo[6.1.0]no-4-ino

Tirosil-tRNA-sintetasa de E. coli mejorada y modificada

P-azido-l-fenilalanina

Spodoptera frugiperda

Gašperšič, J., Kristan, A., Kunej, T., Zupan, IP y Debeljak, N. Eritrocitosis: genes y vías involucradas en el desarrollo de enfermedades. Transferencia de sangre 19, 518–532 (2021).

Google Académico

Ma, Y., Zhou, Z., Yang, G.-Y., Ding, J. & Wang, X. El efecto de la eritropoyetina y sus derivados en la terapia del accidente cerebrovascular isquémico: una revisión exhaustiva. Frente. Farmacol. 13, 743926 (2022).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Tsai, S.-F. & Tarng, D.-C. Anemia en pacientes con enfermedad renal diabética. J. barbilla. Medicina. Asoc. JCMA 82, 752–755 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Lee, JW, Ko, J., Ju, C. & Eltzschig, HK Señalización de hipoxia en enfermedades humanas y dianas terapéuticas. Exp. mol. Medicina. 51, 1–13 (2019).

Artículo PubMed Central PubMed Google Académico

Annese, T., Tamma, R., Ruggieri, S. & Ribatti, D. Eritropoyetina en la angiogénesis tumoral. Exp. Resolución celular 374, 266–273 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rey, F. et al. La eritropoyetina como molécula neuroprotectora: una visión general de su potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas. ASN Neuro 11, 1759091419871420 (2019).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Brunkhorst, R. et al. La darbepoetina alfa mantiene eficazmente las concentraciones de hemoglobina a intervalos de dosis prolongados en relación con la eritropoyetina humana recombinante intravenosa o subcutánea en pacientes en diálisis. nefrol. Marcar. Transpl. 19, 1224–1230 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Curran, MP & McCormack, PL Metoxi polietilenglicol-epoetina beta: una revisión de su uso en el tratamiento de la anemia asociada con la enfermedad renal crónica. Drogas 68, 1139–1156 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nand, N., Nandan, R. & Jain, D. Efectos comparativos de la eritropoyetina pegilada y la darbepoetina alfa en la anemia hiporreactiva a la eritropoyetina de pacientes con enfermedad renal crónica en hemodiálisis de mantenimiento. J. Asociado. física India 69, 11–12 (2021).

Google Académico

Jokerst, JV, Lobovkina, T., Zare, RN & Gambhir, SS PEGilación de nanopartículas para imágenes y terapia. nanomed. (Londres) 6, 715–728 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Ramos-de-la-Peña, AM & Aguilar, O. Avances y desafíos en el procesamiento posterior de proteínas PEGiladas: una revisión de los últimos 8 años. En t. J. Pept. Res. El r. 26, 333–348 (2019).

Artículo Google Académico

Chang, T.-C., Chen, B.-M., Wu, J.-Y., Cheng, T.-L. & Roffler, S. Impacto de la afinidad del anticuerpo anti-PEG en el aclaramiento sanguíneo acelerado de la epoetina beta pegilada en ratones. biomedicina Farmacéutico. 146, 112502 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Grigoletto, A., Tedeschini, T., Canato, E. & Pasut, G. La evolución de la conjugación de polímeros y la orientación de fármacos para la entrega de proteínas y moléculas bioactivas. Wiley Interdiscipl. Rev. Nanomed. Nanobiotecnología. 13, e1689 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Chen, B.-M., Cheng, T.-L. & Roffler, SR Inmunogenicidad del polietilenglicol: aspectos teóricos, clínicos y prácticos de los anticuerpos contra el polietilenglicol. ACS Nano 15, 14022–14048 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Santos, JHPM, Torres-Obreque, KM, Meneguetti, GP, Amaro, BP & Rangel-Yagui, CO PEGilación de proteínas para el diseño de biomejores: desde la reacción hasta los procesos de purificación. Brasil. J. Pharm. ciencia 54, 978 (2018).

Artículo Google Académico

Lubich, C. et al. El misterio de los anticuerpos contra el polietilenglicol (PEG): ¿qué sabemos? Farmacia Res. 33, 2239–2249 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, Q. et al. Análisis de anticuerpos IgG e IgM preexistentes frente al polietilenglicol (PEG) en la población general. Anal. química 88, 11804–11812 (2016).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Garay, RP, El-Gewely, R., Armstrong, JK, Garratty, G. & Richette, P. Anticuerpos contra polietilenglicol en sujetos sanos y en pacientes tratados con agentes conjugados con PEG. Opinión de experto. Entrega de drogas 9, 1319–1323 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chen, B.-M. et al. Medición de anticuerpos IgG e IgM preexistentes contra polietilenglicol en individuos sanos. Anal. química 88, 10661–10666 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liebner, R. et al. Proteína HESylation para la extensión de la vida media: Síntesis, caracterización y farmacocinética de anakinra HESylated. EUR. J. Pharm. Biofarmacia 87, 378–385 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liebner, R., Meyer, M., Hey, T., Winter, G. y Besheer, A. Comparación directa de la formulación y estabilidad de soluciones concentradas de anakinra HESylated versus PEGilated. J. Pharm. ciencia 104, 515–526 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fernandes, AI & Gregoriadis, G. El efecto de la polisialilación sobre la inmunogenicidad y antigenicidad de la asparaginasa: Implicación en su farmacocinética. En t. J. Pharm. 217, 215–224 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Barz, M., Luxenhofer, R., Zentel, R. y Vicent, MJ Superar la adicción a PEG: alternativas bien definidas a PEG, desde relaciones estructura-propiedad hasta terapias mejor definidas. polim. química 2, 1900–1918 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Pouyan, P., Cherri, M. & Haag, R. Poligliceroles como plataformas multifuncionales: síntesis y aplicaciones biomédicas. Polímeros, 14(13), 2684 (2022).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Licha, K. & Resch-Genger, U. Sondas para imágenes ópticas: Nuevos desarrollos. Descubrimiento de drogas Hoy Tecnología. 8, e87-94 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kruger, HR et al. Obtención de imágenes de la liberación de doxorrubicina a partir de profármacos macromoleculares teranósticos a través de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. J.Control. Comunicado 194, 189–196 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Thomas, A., Müller, SS y Frey, H. Más allá del poli(etilenglicol): poliglicerol lineal como poliéter multifuncional para aplicaciones biomédicas y farmacéuticas. Biomacromol 15, 1935-1954 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D. & Schubert, EE. UU. Poli(etilenglicol) en la administración de fármacos: pros y contras, así como posibles alternativas. Angew. química En t. ed. 49, 6288–6308 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Wurm, F., Dingels, C., Frey, H. y Klok, H.-A. Síntesis mediada por ácido escuárico y actividad biológica de una biblioteca de conjugados de poli(glicerol)-proteína lineales e hiperramificados. Biomacromol 13, 1161–1171 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Tully, M. et al. Poliglicerol lineal para la modificación selectiva N-terminal de la interleucina-4. J. Pharm. ciencia 111, 1642-1651 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tully, M. et al. Poliglicerol para la prolongación de la vida media de las proteínas: ¿alternativa a la PEGilación?. Biomacromol 22, 1406–1416 (2021).

Artículo MathSciNet CAS Google Académico

Hauptstein, N. et al. Los conocimientos moleculares sobre los bioconjugados de interferón-α2a específicos del sitio se originaron a partir de PEG, LPG y PEtOx. Biomacromol 22, 4521–4534 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Hauptstein, N. et al. La selección de polímeros afecta el perfil farmacéutico del interferón-α2a conjugado de sitio específico. J. Liberación de control. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2022.05.060 (2022).

Artículo PubMed Google Académico

Chen, S.-Y. et al. Proteínas eritropoyéticas sintéticas: ajuste del rendimiento biológico mediante la unión de polímeros específicos del sitio. química Biol. 12, 371–383 (2005).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kessler, C. et al. El compuesto mimético de eritropoyetina AGEM400 (HES) se une al mismo receptor que la eritropoyetina pero muestra un espectro diferente de actividades. Citocina 57, 226–237 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zemella, A. et al. La síntesis de proteínas libres de células como una herramienta novedosa para la glicoingeniería dirigida de la eritropoyetina activa. ciencia Rep. 8, 8514 (2018).

Artículo ADS PubMed Central PubMed Google Scholar

Stech, M. et al. Síntesis libre de células de anticuerpos funcionales utilizando un sistema acoplado de transcripción-traducción in vitro basado en lisados ​​de células CHO. ciencia Rep. 7, 12030 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Brodel, AK et al. Traducción mediada por IRES de proteínas de membrana y glicoproteínas en sistemas libres de células eucariotas. PLoS ONE 8, e82234 (2013).

Artículo ADS PubMed Central PubMed Google Scholar

Zemella, A., Richter, T., Thoring, L. y Kubick, S. Una síntesis de proteínas sin células combinadas y un enfoque basado en la fluorescencia para investigar las propiedades de unión de GPCR. Métodos Mol. Biol. (Clifton, Nueva Jersey) 1947, 57–77 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Stech, M. et al. Producción de fragmentos de anticuerpos funcionales en un sistema de traducción libre de células eucariotas basado en vesículas. J. Biotecnología. 164, 220–231 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Thoring, L., Zemella, A., Wüstenhagen, D. y Kubick, S. Aceleración de la producción de objetivos farmacológicos: los sistemas libres de células eucariotas entran en el foco. Métodos Protoc. 2(2), 30 (2019).

Artículo Google Académico

Stech, M., Hust, M., Schulze, C., Dübel, S. & Kubick, S. Sistemas eucariotas libres de células para la producción, ingeniería y modificación de fragmentos de anticuerpos scFv. Ing. Ciencias de la vida 14, 387–398 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ramm, F. et al. La expresión de proteínas libres de células de mamífero promueve la caracterización funcional de la enterotoxina no hemolítica tripartita de Bacillus cereus. ciencia Rep. 10, 2887 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Cheetham, JC et al. Estructura de RMN de la eritropoyetina humana y una comparación con su conformación unida al receptor. Nat. Estructura. Biol. 5, 861–866 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fruijtier-Pölloth, C. Evaluación de la seguridad de los polietilenglicoles (PEG) y sus derivados utilizados en productos cosméticos. Toxicología 214, 1–38 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Jang, J. Informe final sobre la evaluación de la seguridad de los polietilenglicoles (PEG)-6,-8,-32,-75,-150,-14M,-20M. Mermelada. Col. Toxicol. 12, 429–457 (1993).

Artículo Google Académico

Jang, H.-J., Shin, CY y Kim, K.-B. Evaluación de seguridad de compuestos de polietilenglicol (PEG) para uso cosmético. Toxicol. Res. 31, 105–136 (2015).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Shimizu, T. et al. La administración intravenosa de proteínas recubiertas de polietilenglicol (PEGiladas) y adenovirus pegilados provoca una respuesta de inmunoglobulina M anti-PEG. Biol. Farmacia Toro. 35, 1336–1342 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ishida, T. et al. La inyección de liposomas PEGilados en ratas provoca IgM específica de PEG, que es responsable de la eliminación rápida de una segunda dosis de liposomas PEGilados. J.Control. Versión 112, 15–25 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Armstrong, JK et al. El anticuerpo contra el poli(etilenglicol) afecta negativamente a la terapia con PEG-asparaginasa en pacientes con leucemia linfoblástica aguda. Cáncer 110, 103–111 (2007).

Artículo PubMed Google Académico

Lipsky, PE et al. Inmunogenicidad pegloticasa: La relación entre la eficacia y el desarrollo de anticuerpos en pacientes tratados por gota crónica refractaria. Artritis Res. El r. 16, R60 (2014).

Artículo PubMed Central PubMed Google Académico

Chang, T.-C. et al. Tanto los anticuerpos IgM como los IgG contra el polietilenglicol pueden alterar la actividad biológica del metoxipolietilenglicol-epoetina beta en ratones. Farmacéutica 12, 25 (2019).

Artículo MathSciNet Google Académico

Abbina, S. & Parambath, A. Ingeniería de biomateriales para sistemas de administración de fármacos. En Woodhead Publishing Series in Biomaterials (ed. Parambath, A.) 363–376 (Woodhead Publishing, Reino Unido, 2018).

Google Académico

Zhang, P., Sun, F., Liu, S. y Jiang, S. Anticuerpos anti-PEG en la clínica: Problemas actuales y más allá de la PEGilación. J. Control Release 244, 184–193 (2016).

Artículo CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Hoang-Thi, TT et al. La importancia de las alternativas de poli(etilenglicol) para superar la inmunogenicidad de PEG en la administración y bioconjugación de fármacos. Polímeros (Basilea) 12, 298 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Abu-Lila, AS, Nawata, K., Shimizu, T., Ishida, T. & Kiwada, H. El uso de poliglicerol (PG), en lugar de polietilenglicol (PEG), previene la inducción del fenómeno de eliminación acelerada de sangre contra largo - liposomas circulantes tras la administración repetida. En t. J. Pharmaceut. 456, 235–242 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Imran-ul-haq, M., Lai, BFL, Chapanian, R. & Kizhakkedathu, JN Influencia de la arquitectura de poligliceroles lineales y ramificados de alto peso molecular en su biocompatibilidad y biodistribución. Biomateriales 33, 9135–9147 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kainthan, RK, Janzen, J., Levin, E., Devine, DV y Brooks, DE Pruebas de biocompatibilidad de poliglicidol ramificado y lineal. Biomacromol 7, 703–709 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Odom, OW, Kudlicki, W., Kramer, G. & Hardesty, B. Un efecto del polietilenglicol 8000 sobre la movilidad de proteínas en la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida y un método para eliminar este efecto. Anal. Bioquímica 245, 249–252 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Eckardt, K.-U. et al. Evaluación de la estabilidad de la eritropoyetina humana en muestras para radioinmunoensayo. Klin. Wochenschr. 66, 241–245 (1988).

Artículo CAS PubMed Google Académico

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Para la preparación del lisado Sf21, los autores desean agradecer a D. Wenzel y Dipl. En g. (FH) DA Wüstenhagen (Fraunhofer IZI-BB, Potsdam-Golm, Alemania).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia, Investigación y Cultura (MWFK, Brandeburgo, Alemania), el proyecto PZ-Syn (número de proyecto F241-03-FhG/005/001) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, Alemania), proyecto CEFOX (031B0831) y proyecto Next-PEG (13XP5049A).

Estos autores contribuyeron por igual: Paria Pouyan, Anne Zemella, Rainer Haag y Stefan Kubick.

Instituto de Química y Bioquímica, Universidad Libre de Berlín, Takustr. 3, 14195, Berlín, Alemania

Paria Pouyan y Rainer Haag

Instituto Fraunhofer de Terapia Celular e Inmunología (IZI), Branch Bioanalytics and Bioprocesses (IZI-BB), Am Mühlenberg 13, 14476, Potsdam, Alemania

Anne Zemella, Jeffrey L. Schloßhauer, Ruben M. Walter y Stefan Kubick

Instituto de Química y Bioquímica-Bioquímica, Universidad Libre de Berlín, Takustr. 6, 14195, Berlín, Alemania

Jeffrey L. Schlosshauer y Stefan Kubick

Instituto de Biotecnología, Universidad Técnica de Berlín, Gustav-Meyer-Allee 25, 13355, Berlín, Alemania

Rubén M. Walter

Facultad de Ciencias de la Salud, Facultad unida de la Universidad Tecnológica de Brandeburgo Cottbus-Senftenberg, la Facultad de Medicina de Brandeburgo Theodor Fontane y la Universidad de Potsdam, Potsdam, Alemania

Stefan Kubick

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PP: conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, validación, visualización, redacción; AZ: conceptualización, curación de datos, análisis formal, investigación, metodología, validación, visualización, redacción; JLS: curación de datos, revisión; RMW: curación de datos, revisión, SK: conceptualización, adquisición de fondos, administración de proyectos, recursos, supervisión, validación, revisión, edición, RH: conceptualización, adquisición de fondos, administración de proyectos, recursos, supervisión, validación, revisión, edición

Correspondencia a Anne Zemella o Rainer Haag.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Pouyan, P., Zemella, A., Schloßhauer, JL et al. Comparación uno a uno de conjugados de eritropoyetina sintetizados libres de células modificados con poliglicerol lineal y polietilenglicol. Informe científico 13, 6394 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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Recibido: 25 enero 2023

Aceptado: 13 de abril de 2023

Publicado: 19 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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