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Dec 05, 2023

Eliminación del autismo

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 593 (2023) Citar este artículo

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CHD8 codifica la proteína 8 de unión al ADN cromodominio helicasa y su mutación es un factor de riesgo altamente penetrante para el trastorno del espectro autista (TEA). CHD8 sirve como un regulador transcripcional clave sobre la base de su actividad de remodelación de la cromatina y, por lo tanto, controla la proliferación y diferenciación de las células progenitoras neurales. Sin embargo, la función de CHD8 en las neuronas posmitóticas y el cerebro adulto sigue sin estar clara. Aquí mostramos que la eliminación homocigótica de Chd8 en neuronas posmitóticas de ratón da como resultado una regulación negativa de la expresión de genes neuronales y altera la expresión de genes dependientes de la actividad inducida por la despolarización neuronal mediada por KCl. Además, la ablación homocigota de CHD8 en ratones adultos se asoció con la atenuación de las respuestas transcripcionales dependientes de la actividad en el hipocampo a las convulsiones inducidas por ácido kaínico. Nuestros hallazgos implican a CHD8 en la regulación transcripcional en neuronas posmitóticas y el cerebro adulto, y sugieren que la interrupción de esta función podría contribuir a la patogénesis del TEA asociada con la haploinsuficiencia de CHD8.

El trastorno del espectro autista (TEA) es una condición heterogénea definida por déficits en la interacción social y la comunicación, así como por conductas restringidas y repetitivas. Las personas con TEA a menudo manifiestan síntomas adicionales, como convulsiones, ansiedad y discapacidad intelectual1. La disfunción sináptica es una característica clave de la patología ASD y también es evidente en el cerebro de varios modelos de ratón de la enfermedad2,3,4. La actividad neuronal desencadenada por las experiencias contribuye a la regulación del desarrollo y la función sináptica en los circuitos neuronales al inducir la transcripción de múltiples genes5,6, lo que sugiere que la disfunción de dicha regulación transcripcional dependiente de la actividad puede contribuir al desarrollo de TEA.

Las mutaciones en el gen que codifica la proteína 8 de unión al ADN de cromodominio helicasa (CHD8) constituyen un factor de riesgo altamente penetrante para los TEA7,8. CHD8 es un factor de remodelación de la cromatina dependiente de ATP que se dirige a las regiones promotoras de muchos genes, incluidas las de otros genes asociados con los TEA, y por lo tanto regula su transcripción9,10,11. Se ha encontrado que los ratones mutantes heterocigotos Chd8 manifiestan macrocefalia, mayor comportamiento similar a la ansiedad, comportamiento social alterado y déficits cognitivos, pero los fenotipos conductuales de diferentes líneas de ratones mutantes Chd8 generados por diferentes grupos se superponen solo parcialmente12,13,14,15,16 ,17. La pérdida de CHD8 también da como resultado una proliferación y diferenciación deficientes de las células precursoras de las neuronas excitatorias del prosencéfalo y de las células granulares del cerebelo durante el desarrollo cortical y cerebeloso18,19. Además, CHD8 juega un papel clave en la diferenciación y mielinización de oligodendrocitos, y su ablación en células precursoras de oligodendrocitos de ratones da como resultado el desarrollo de algunos de los fenotipos conductuales característicos de ratones mutantes heterocigotos Chd820,21,22. Aunque estas diversas observaciones implican a CHD8 como un regulador central de la proliferación y diferenciación de las células progenitoras en el cerebro, se desconoce si CHD8 también juega un papel importante en las neuronas posmitóticas y el cerebro adulto.

Ahora hemos examinado las consecuencias de la eliminación de Chd8 en neuronas postmitóticas de ratón tanto in vitro como en el cerebro adulto in vivo con el uso de un sistema de recombinación Cre inducible por tamoxifeno. Encontramos que CHD8 regula la expresión de genes neuronales y genes dependientes de actividad en neuronas cultivadas. También encontramos que la eliminación de Chd8 en el cerebro adulto da como resultado una regulación negativa de la expresión génica dependiente de la actividad asociada con las convulsiones inducidas por el ácido kaínico (KA). Nuestros resultados indican que CHD8 sirve como un regulador transcripcional no solo en células progenitoras neurales sino también en neuronas posmitóticas.

Para investigar el papel de CHD8 en las neuronas posmitóticas, cultivamos neuronas hipocampales primarias derivadas de ratones knockout (CAG-CreER/Chd8F/F) y control (Chd8F/F) de Chd8 mediados por recombinasa Cre en el día embrionario (E) 18.5 (Fig. 1a). Los cultivos se trataron con citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C) para eliminar las células en división y luego se expusieron a 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) para generar neuronas de desactivación condicional de Chd8 (Chd8 CKO). La abundancia de ARNm de Chd8 en cultivos de Chd8 CKO se redujo considerablemente en comparación con la de los cultivos de control (Fig. 1b). Las células cultivadas comprendían ~ 17 % de astrocitos y ~ 1 % de oligodendrocitos además de neuronas, pero la proporción de cada tipo de célula y la viabilidad celular fueron similares para Chd8 CKO y cultivos de control (Fig. 1c, Fig. 1 complementaria). Realizamos un análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) con estas neuronas Chd8 CKO y de control (Tabla complementaria 1). La expresión de 509 genes se reguló a la baja y la de 360 ​​genes se reguló al alza en las neuronas Chd8 CKO en comparación con las neuronas de control (tasa de descubrimiento falso (FDR) - valor de P ajustado de <0.05) (Fig. 1d). El análisis de ontología génica (GO) reveló que los 509 genes regulados a la baja en las neuronas Chd8 CKO estaban enriquecidos en genes relacionados con "traducción", "transcripción, plantilla de ADN", "desarrollo del sistema nervioso" y "regulación positiva del ensamblaje de sinapsis", mientras que los 360 genes regulados al alza mostraron un enriquecimiento significativo de genes relacionados con el "proceso metabólico de aminoácidos celulares" y el "transporte" (Fig. 1e). El análisis SynGO reveló que los genes regulados a la baja en las neuronas Chd8 CKO se enriquecieron en genes relacionados con la función pre y postsináptica, mientras que los genes regulados al alza no mostraron un enriquecimiento significativo (Fig. 1f, Fig. 2 complementaria). Además, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para las vías de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) mostró que los genes ribosómicos estaban significativamente regulados a la baja en las neuronas Chd8 CKO (Fig. 1g).

una Representación esquemática del procedimiento experimental para el cultivo de neuronas primarias, eliminación de Chd8 por recombinación mediada por Cre y despolarización neuronal inducida por KCl (ver Métodos para más detalles). El bloqueador de los canales de Na+ tetrodotoxina (TTX) y el antagonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) D-AP5 se agregaron a las neuronas para reducir la actividad neuronal antes de la despolarización inducida por KCl. b Análisis de transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real del ARNm de Chd8 en neuronas de control y Chd8 CKO tratadas con KCl 5 o 55 mM. Los datos son medias ± sem (n = 3 ratones de cada genotipo). **P < 0,01, ****P < 0,0001 (ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Tukey). c Micrografías de contraste de fase de neuronas primarias cultivadas durante 10 días. Barras de escala, 50 µm. d Gráfica de volcán para genes expresados ​​diferencialmente en neuronas Chd8 CKO en comparación con neuronas de control bajo la condición de KCl 5 mM según lo determinado por análisis de secuencia de ARN (n = 3 ratones de cada genotipo, 1 macho y 2 hembras para ratones Chd8 CKO y 2 machos y 1 hembra para los ratones de control). Los genes expresados ​​diferencialmente (valor de P ajustado por FDR de <0,05) se resaltan en rojo. Análisis eGO de genes cuya expresión estaba regulada al alza (360 genes) o regulada a la baja (509 genes) en neuronas Chd8 CKO. f Análisis SynGO de genes cuya expresión estaba regulada a la baja (509 genes) en neuronas Chd8 CKO. g GSEA para las vías KEGG en neuronas Chd8 CKO en comparación con neuronas de control en la condición de KCl 5 mM. NES, puntuación de enriquecimiento normalizado.

La despolarización neuronal mediada por un aumento en la concentración de KCl extracelular induce la expresión de genes dependientes de la actividad23. Por lo tanto, a continuación examinamos si la inducción de la expresión génica en respuesta a la actividad neuronal se ve alterada por la ablación de Chd8 en neuronas posmitóticas cultivadas. Las neuronas de control tratadas con KCl 55 mM durante 2 h mostraron un aumento significativo en la expresión de genes dependientes de la actividad como Arc, Egr1, Fos, Fosb, Npas4 y Nr4a1 en comparación con las tratadas con KCl 5 mM (Fig. 2a, Suplementario Tabla 2). La abundancia máxima de ARNm se produjo a ~ 1 h para Egr1 y a ~ 2 h para Fosb y Nr4a1, y las cantidades de estos ARNm disminuyeron gradualmente a partir de entonces (Fig. 3a-c complementaria). Para las neuronas tratadas con KCl 55 mM, la expresión de 775 genes se reguló a la baja y la de 404 genes se reguló al alza mediante la ablación de Chd8 (FDR ajustado P <0.05) (Fig. 2b, Tabla complementaria 3). Entre estos genes expresados ​​​​diferencialmente, la expresión de genes dependientes de la actividad, incluidos Egr1, Fosb y Nr4a1, se reguló significativamente a la baja en las neuronas Chd8 CKO (Fig. 2b, c). El análisis de inmunotransferencia confirmó que la expresión dependiente de la actividad de FOSB a nivel de proteína se atenuó significativamente en las neuronas Chd8 CKO en comparación con las neuronas de control (Fig. 3d-f complementaria). También examinamos nuestros datos de RNA-seq para los genes inducidos por 190 KCl con un log2 (cambio de pliegue) de> 2.0 asociado con un valor de P ajustado por FDR de <0.01 en neuronas de control tratadas con 55 mM KCl en comparación con aquellas tratadas con 5 KCl mM (Fig. 2a). GSEA reveló que la expresión de estos genes inducidos por KCl se reguló a la baja en Chd8 CKO frente a las neuronas de control en la condición de KCl 55 mM (Fig. 2d). Además, el análisis SynGO y GSEA para las vías KEGG revelaron que los genes con una expresión significativamente regulada a la baja en las neuronas Chd8 CKO frente a las neuronas de control en esta condición incluían los relacionados con las sinapsis y los ribosomas (Fig. 4a-c complementaria). La comparación de genes expresados ​​​​diferencialmente (P ajustado por FDR <0.05) entre Chd8 CKO y neuronas de control en condiciones de KCl 5 y 55 mM mostró que 227 genes regulados al alza y 426 genes regulados a la baja se identificaron específicamente mediante el tratamiento con KCl 55 mM (Fig. 2e, Fig. Suplementaria 4d–f, Tabla Suplementaria 4). El análisis GO reveló que estos genes regulados negativamente se enriquecieron en genes relacionados con "transcripción, plantilla de ADN", "procesamiento de ARNm", "desarrollo del sistema nervioso" y "respuesta celular al ion de calcio" (Fig. 2f).

un diagrama de volcán para genes expresados ​​diferencialmente en neuronas aisladas de ratones de control y tratados con KCl 55 mM frente a KCl 5 mM (n = 3 ratones por condición). Los genes expresados ​​diferencialmente (valor de P ajustado por FDR de <0,05) se resaltan en rojo. b Gráfica de volcán para genes expresados ​​diferencialmente en neuronas Chd8 CKO en comparación con neuronas de control en condiciones de KCl 55 mM (n = 3 ratones de cada genotipo, 1 macho y 2 hembras para ratones Chd8 CKO y 2 machos y 1 hembra para ratones de control). Los genes expresados ​​diferencialmente (valor de P ajustado por FDR de <0,05) se resaltan en rojo. c Mapa de calor que representa la expresión de genes dependientes de la actividad en Chd8 CKO y neuronas de control en las condiciones de KCl 5 y 55 mM (n = 3 ratones para cada condición). Los genes expresados ​​diferencialmente en las neuronas Chd8 CKO en comparación con las neuronas de control en la condición de KCl 55 mM se indican mediante asteriscos. d Gráfica GSEA de genes expresados ​​diferencialmente entre genes inducidos por KCl (genes regulados positivamente con un log2 (cambio de pliegue) de> 2 asociado con un valor de P ajustado por FDR de <0.01 en neuronas de ratones de control tratados con KCl 55 mM en comparación con los tratados con KCl 5 mM en a) para las neuronas Chd8 CKO en comparación con las neuronas de control en la condición de KCl 55 mM. NES, puntuación de enriquecimiento normalizado. e Diagramas de Venn que muestran la superposición entre los genes cuya expresión estaba regulada al alza o a la baja en las neuronas Chd8 CKO en comparación con las neuronas de control en las condiciones de KCl 5 y 55 mM. f Análisis GO de genes cuya expresión se regulaba específicamente al alza (227 genes) o a la baja (426 genes) en neuronas Chd8 CKO tratadas con KCl 55 mM como se indica en e. Los niveles de significación para los valores de P y FDR q se indican con * para <0,05, ** para <0,01, *** para <0,001 y **** para <0,0001.

Dada la función de CHD8 como factor de remodelación de la cromatina, realizamos un ensayo de cromatina accesible por transposasa (ATAC)-seq para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma en Chd8 CKO y controlar las neuronas después del tratamiento con KCl 5 o 55 mM durante 2 h . La mayoría de los picos de ATAC-seq (50,2 a 78,2 % del total de picos) se compartieron entre estas cuatro condiciones (Fig. 3a). El mapa de calor y los perfiles de densidad alrededor de los picos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)-seq de CHD8 de alta confianza de los datos publicados previamente12 revelaron patrones de distribución similares de intensidad de señal ATAC-seq entre Chd8 CKO y las neuronas de control (Fig. 3b, Suplementario Fig. 5a). También examinamos la accesibilidad a la cromatina en los loci de varios genes dependientes de la actividad, incluidos Fosb, Nr4a1, Homer1 y Egr3, todos los cuales estaban regulados a la baja en las neuronas Chd8 CKO en comparación con las neuronas de control en la condición de KCl 55 mM. Se detectaron picos de CHD8 que se superpusieron con sitios de cromatina accesibles en o cerca de estos loci genómicos (Fig. 3c). Aunque la intensidad de la señal de varios picos de ATAC-seq en estas regiones aumentó en respuesta a la actividad neuronal, los patrones de distribución de la señal fueron similares para los dos genotipos (Fig. 3c, Fig. 5b complementaria). Además, realizamos un análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de ChIP para examinar los efectos de la eliminación de Chd8 en la abundancia de Lys4 trimetilada de la histona H3 (H3K4me3) y el reclutamiento de ARN polimerasa II. El grado de enriquecimiento de H3K4me3 o ARN polimerasa II alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) de varios genes dependientes de la actividad tendió a ser mayor en las neuronas Chd8 CKO que en las neuronas de control bajo la condición de KCl 55 mM, pero estas diferencias no lograron significación estadística. (Fig. 3d, e).

un diagrama de Venn que muestra la superposición entre los picos de ATAC-seq detectados en Chd8 CKO o neuronas de control aisladas de ratones macho y expuestas a KCl 5 o 55 mM (n = 2 ratones por condición). Se usaron para el análisis los datos combinados de dos réplicas ATAC-seq independientes para cada condición. Los resultados separados de las dos réplicas para cada condición se muestran en la Fig. 5 complementaria. b Agrupación de densidad de señal y mapas de calor de picos ATAC-seq en la región que abarca 3 kb aguas arriba a 3 kb aguas abajo del centro de los picos de unión CHD8. Los datos de CHD8 ChIP-seq son de un estudio anterior12. c Datos de ATAC-seq, CHD8 ChIP-seq y RNA-seq para genes representativos dependientes de la actividad vistos en el navegador Integrative Genomics Viewer. Las áreas sombreadas en amarillo indican picos prominentes superpuestos de ATAC-seq y ChIP-seq. d, e Se realizó un análisis de ChIP-qPCR para la deposición de H3K4me3 (d) y la unión de la ARN polimerasa II (e) en la región TSS de los genes dependientes de la actividad indicados (o en la región aguas arriba de Homer1 examinada como control negativo) en el hipocampo neuronas aisladas de Chd8 CKO o ratones de control y tratadas con KCl 55 mM durante 2,0 h. ChIP se realizó con inmunoglobulina G (IgG) normal como control para los anticuerpos contra H3K4me3 o contra la ARN polimerasa II. Los datos son medias ± sem (n = 3 experimentos independientes). Los valores de P se determinaron con la prueba t de Student para datos no apareados.

A continuación, generamos ratones con deficiencia de CHD8 en la edad adulta (en adelante, ratones Chd8 CKO) administrando tamoxifeno a ratones CAG-CreER/Chd8F/F de 8 a 12 semanas de edad por vía intraperitoneal durante cinco días consecutivos. Confirmamos que los alelos floxed (F) de Chd8 se eliminaron de manera eficiente en el hipocampo de ratones Chd8 CKO como se refleja en la pérdida de expresión de Chd8 en los niveles de ARNm y proteína (Fig. 4a, Fig. 6a complementaria, b). Para examinar si CHD8 regula la expresión de genes dependientes de la actividad in vivo, inducimos una actividad neuronal generalizada en el cerebro de Chd8 CKO y controlamos ratones mediante la inyección del agonista del receptor de glutamato KA. Aunque no detectamos una diferencia significativa en la gravedad de las convulsiones entre Chd8 CKO y los ratones de control después del tratamiento con KA (Fig. 4b), la expresión de genes dependientes de la actividad, incluidos Fosb, Nr4a1 y Egr1 en el hipocampo, se reguló significativamente a la baja en ratones Chd8 CKO en relación con los ratones de control con una etapa de convulsiones similar a los 60 minutos después del tratamiento con KA (Fig. 4c). La abundancia de proteína FOSB también se redujo significativamente en el hipocampo de los ratones Chd8 CKO en comparación con la de los ratones de control después del tratamiento con KA (Figuras complementarias 6a, c). Para examinar si la ablación de Chd8 altera la accesibilidad de la cromatina in vivo, realizamos análisis ATAC-seq para el hipocampo de Chd8 CKO y ratones de control después del tratamiento con vehículo o de aquellos con una etapa de convulsión similar a los 60 minutos después del tratamiento con KA. La mayoría de los picos de ATAC-seq (51,6 a 74,0 % del total de picos) se compartieron entre estas cuatro condiciones (Fig. 4d). El mapa de calor y los perfiles de densidad alrededor de los picos de ChIP-seq de CHD8 de alta confianza revelaron una pequeña disminución en la intensidad de la señal de ATAC-seq en el hipocampo de los ratones Chd8 CKO en comparación con la de los ratones de control después del tratamiento con KA o vehículo (Fig. 4e, Fig. complementaria). 7a). La accesibilidad a la cromatina en el cuerpo del gen de varios genes dependientes de la actividad, incluidos Fosb, Nr4a1 y Egr1, aumentó con el tratamiento con KA tanto en el control como en el hipocampo Chd8 CKO (Fig. 4f, Fig. 7b complementaria). Además, la intensidad de la señal de ATAC-seq en estos loci disminuyó en el hipocampo de los ratones Chd8 CKO en comparación con la de los ratones de control después del tratamiento con KA (Fig. 4f, Fig. 7b complementaria). Estos resultados indicaron que CHD8 es esencial para la transcripción y accesibilidad de la cromatina en genes dependientes de actividad en neuronas activadas in vivo.

un análisis RT-qPCR del ARNm de Chd8 en el hipocampo de ratones macho CAG-CreER/Chd8F/F (Chd8 CKO) y Chd8F/F (control) a las 17 a 18 semanas de edad después del tratamiento con tamoxifeno durante cinco días consecutivos a las 8 a 12 semanas de edad (n = 6 ratones de cada genotipo). b Evolución temporal de la puntuación de convulsiones durante 60 min después de la inyección de KA en ratones macho Chd8 CKO (n = 12) y control (n = 14) entre 16 y 18 semanas de edad (panel izquierdo) o Chd8 CKO (n = 18) y control (n = 16) ratones hembra entre 13 y 18 semanas de edad (panel derecho). c Análisis RT-qPCR de la abundancia de ARNm para los genes dependientes de la actividad indicados en el hipocampo de ratones Chd8 CKO tratados con vehículo (n = 6), ratones de control tratados con vehículo (n = 6), ratones Chd8 CKO tratados con KA (n = 9), y ratones de control tratados con KA (n = 7) a las 16 a 18 semanas de edad. Para este análisis se estudiaron ratones macho con una etapa de convulsiones de 3 a 5. Los datos son medias ± sem d Diagrama de Venn que muestra la superposición entre los picos de ATAC-seq detectados en el hipocampo de Chd8 CKO y ratones de control con una etapa de convulsión similar a los 60 min después del tratamiento con KA o vehículo (n = 2 ratones por condición: 1 macho y 1 hembra para Chd8 CKO y ratones de control tratados con KA, 2 machos para Chd8 CKO y ratones de control tratados con vehículo). Se usaron para el análisis los datos combinados de dos réplicas ATAC-seq independientes para cada condición. Los resultados separados para las dos réplicas de cada condición se muestran en la Fig. 7 complementaria. e Agrupación de densidad de señal y mapas de calor de picos ATAC-seq en la región que abarca 3 kb aguas arriba a 3 kb aguas abajo del centro de los picos de unión CHD8. f Señales ATAC-seq de genes representativos dependientes de la actividad vistos en el navegador Integrative Genomics Viewer. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (prueba t de Student no apareada en (a), ANOVA bidireccional repetida en (b) y ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey en (c)).

Dado que la desregulación de la expresión génica dependiente de la actividad está asociada con la formación de la memoria y trastornos psiquiátricos5,6, realizamos varias pruebas de comportamiento con Chd8 CKO y ratones macho y hembra de control. En la prueba del laberinto acuático de Morris, las pruebas de plataforma visible y oculta durante cinco días consecutivos revelaron que la latencia de escape fue similar en Chd8 CKO y ratones de control (Fig. 5a). Después de entrenar en las pruebas de plataforma visible y oculta, realizamos una prueba de prueba en la que se retiró la plataforma oculta del laberinto de agua. El número de cruces de la plataforma objetivo no difirió entre Chd8 CKO y los ratones macho o hembra de control (Fig. 5b). El tiempo pasado en el cuadrante objetivo aumentó significativamente en relación con el de cada uno de los otros cuadrantes tanto para Chd8 CKO como para ratones de control (Fig. 5c), lo que sugiere un aprendizaje normal y formación de memoria en ratones Chd8 CKO.

a Latencia para alcanzar las plataformas visibles y ocultas en la prueba del laberinto acuático de Morris para Chd8 CKO (n = 18) y control (n = 20) ratones macho de 11 a 15 semanas de edad (panel izquierdo) o para Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 18) ratones hembra de entre 11 y 16 semanas de edad (panel derecho). Los datos son medias ± sem b, c Número de cruces de destino (b) y tiempo pasado en cada cuadrante (c) después de retirar la plataforma el día 6 para la prueba de sonda de la prueba del laberinto acuático de Morris realizada con los ratones en (a). T, O, L y R representan los cuadrantes objetivo, opuesto, izquierdo y derecho, respectivamente. El círculo gris representa la plataforma de destino. Los datos se presentan como diagramas de caja y bigotes, en los que los bordes inferior y superior del cuadro indican los percentiles 25 y 75, respectivamente, la barra central indica la mediana y los bigotes indican extremos no atípicos. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (ANOVA repetido de dos vías (a), ANOVA factorial de dos vías (b) o ANOVA de una vía con la prueba post hoc de Tukey ( C)).

A continuación, examinamos el comportamiento similar a la ansiedad y el comportamiento social anormal típico de los ratones modelo ASD, incluidos los ratones CHD8-haploinsuficientes12,13,14,15. La distancia total recorrida en la prueba de campo abierto no difirió entre los genotipos, lo que sugiere una actividad locomotora normal en ratones Chd8 CKO (Fig. 6a). Mientras que el tiempo pasado en el centro del campo abierto disminuyó para los ratones macho Chd8 CKO en comparación con los ratones de control, el de los ratones hembra Chd8 CKO fue similar al de los ratones de control (Fig. 6b). No detectamos una diferencia entre los genotipos para el tiempo que pasaron en los brazos abiertos durante la prueba del laberinto en cruz elevado o para el tiempo que pasaron en la sala de luz durante la prueba de transición luz-oscuridad (Fig. 6c, d). Los ratones machos y hembras Chd8 CKO también mostraron un comportamiento normal de aseo personal (Fig. 6e). Los ratones Chd8 CKO hembras, pero no machos, mostraron un aumento en el tiempo de contacto total durante la prueba de interacción social recíproca (Fig. 6f). La cantidad de contactos sociales durante esta prueba no difirió entre Chd8 CKO y los ratones de control (Fig. 6g). En la prueba de sociabilidad de tres cámaras, tanto Chd8 CKO como los animales de control mostraron una preferencia significativa por un ratón nuevo (extraño 1) (Fig. 6h, i). En la prueba de preferencia por la novedad social, tanto los ratones Chd8 CKO como los machos de control también mostraron una preferencia significativa por un ratón nuevo (extraño 2) sobre un ratón familiar (extraño 1), mientras que las hembras de cualquiera de los genotipos no mostraron tal preferencia ( Fig. 6j, k). Estos resultados sugirieron que la ablación de Chd8 en el cerebro adulto tiene efectos selectivos sobre las características del comportamiento.

a, b Distancia total recorrida (a) y tiempo de permanencia en el área central (b) para la prueba de campo abierto realizada con ratones macho Chd8 CKO (n = 18) y control (n = 20) entre 14 y 16 semanas de edad o con Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 18) ratones hembra de entre 12 y 17 semanas de edad. c Tiempo pasado en los brazos abiertos para la prueba del laberinto en cruz elevado realizada con ratones macho Chd8 CKO (n = 18) y control (n = 20) a las 15 a 17 semanas de edad o con Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 18) ratones hembra entre 12 y 17 semanas de edad. d Tiempo de permanencia en la cámara de luz para la prueba de transición luz-oscuridad realizada con ratones machos Chd8 CKO (n = 18) y control (n = 20) entre 14 y 17 semanas de edad o con Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 18) ratones hembra entre 12 y 17 semanas de edad. e Duración total del aseo personal durante un período de 10 minutos para Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 17) ratones macho de entre 11 y 16 semanas de edad o para Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 18) ratones hembra entre 13 y 18 semanas de edad. f, g Duración total de los contactos (f) y número de contactos (g) para la prueba de interacción social en un entorno novedoso realizado con ratones macho Chd8 CKO (n = 9) y control (n = 10) a las 15 a 17 semanas de edad o con Chd8 CKO (n = 7) y control (n = 9) ratones hembra entre 12 y 17 semanas de edad. h, i Rastros representativos para ratones macho (h) y tiempo pasado alrededor de cada jaula (i) para la prueba de sociabilidad de tres cámaras realizada con Chd8 CKO (n = 18) y control (n = 20) ratones macho a las 16 a 18 semanas de edad o con Chd8 CKO (n = 16) y control (n = 18) ratones hembra entre 13 y 17 semanas de edad. Barras de escala, 5 cm. j, k Rastros representativos para ratones macho (j) y tiempo pasado alrededor de cada jaula (k) para la prueba de preferencia de novedad social de tres cámaras realizada con los ratones en h e i. Barras de escala, 5 cm. Los datos se presentan como diagramas de caja y patillas, en los que los bordes inferior y superior de la caja indican los percentiles 25 y 75, respectivamente, la barra central indica la mediana y las patillas indican extremos no atípicos (a–g, i, k). *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001 (ANOVA factorial bidireccional con prueba post hoc de Tukey (a–g) o prueba t de Student pareada (i, k)).

Aquí hemos demostrado que la eliminación homocigota de Chd8 en neuronas posmitóticas de ratón altera la expresión de genes dependientes de la actividad. También encontramos que la expresión de Chd8 en el cerebro adulto no es esencial para la susceptibilidad a las convulsiones o para la formación de memoria en la prueba del laberinto acuático de Morris, pero es necesaria para la transcripción de genes dependientes de la actividad asociados con las convulsiones inducidas por KA. Por lo tanto, nuestros datos brindan información sobre el papel de CHD8 en las respuestas transcripcionales dependientes de la actividad en las neuronas postmitóticas.

Se ha demostrado previamente que CHD8 regula la proliferación y diferenciación de muchos tipos de células madre y precursoras a través del control transcripcional18,19,20,21,24,25,26. Aunque la expresión de Chd8 persiste en el cerebro adulto27, el papel funcional de CHD8 en las neuronas posmitóticas no está claro. Nuestros resultados ahora muestran que CHD8 contribuye a la regulación transcripcional en respuesta a la actividad neuronal. La expresión génica dependiente de la actividad media el desarrollo sináptico y la plasticidad subyacente al aprendizaje y la memoria6, y su interrupción está relacionada con trastornos neuropsiquiátricos como ASD5. Mientras que detectamos anomalías conductuales selectivas, incluido un aumento del comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto en ratones machos Chd8 CKO y comportamiento social anormal en ratones hembra Chd8 CKO en este estudio, los ratones heterocigotos knockout Chd8 manifiestan alteraciones en la transmisión sináptica, comportamiento similar a ASD fenotipos y déficits de aprendizaje y memoria12,13,14,15,28. Por lo tanto, nuestras observaciones sugieren que la regulación transcripcional dependiente de la actividad defectuosa por parte de CHD8 puede contribuir a los fenotipos neurológicos de las personas con TEA asociados con mutaciones en CHD8. Además de los cambios en la expresión de los genes dependientes de la actividad, encontramos que los genes relacionados con la traducción estaban muy enriquecidos entre los genes regulados a la baja en las neuronas Chd8 CKO. La traducción local en las neuronas suministra proteínas a los axones y sinapsis que se requieren para la plasticidad sináptica y la función neuronal29. La desregulación de la traducción se ha implicado previamente en fenotipos similares a ASD30. Por lo tanto, CHD8 contribuye a la regulación transcripcional relacionada con múltiples procesos, incluida la transcripción, la traducción y el desarrollo del sistema nervioso, y la regulación defectuosa de estos procesos asociados con la mutación CHD8 podría ser la base de la patogénesis del TEA.

La actividad neuronal modifica dinámicamente el paisaje de cromatina accesible en asociación con la expresión génica dependiente de la actividad en el cerebro adulto31. Por el contrario, nuestro análisis ATAC-seq reveló solo pequeños cambios en la accesibilidad de la cromatina en neuronas cultivadas expuestas a una concentración extracelular elevada de KCl, similar a hallazgos anteriores32. Estas diferencias en los efectos de la actividad neuronal sobre la accesibilidad de la cromatina pueden deberse a las diferencias en las condiciones experimentales entre las neuronas in vivo y aquellas en cultivo. De hecho, nuestro análisis ATAC-seq del hipocampo de ratones tratados con KA reveló un aumento en la accesibilidad a la cromatina en el cuerpo genético de los genes dependientes de la actividad. De acuerdo con hallazgos previos de que CHD8 promueve la adopción de estructuras de cromatina abierta en varios tipos de células19,20,33, encontramos que la ablación de Chd8 en el cerebro adulto redujo la accesibilidad a la cromatina en los loci de los genes dependientes de la actividad. Aunque no detectamos cambios en la accesibilidad de la cromatina en respuesta a la eliminación de Chd8 in vitro, probablemente como resultado de limitaciones técnicas, es posible que CHD8 también afecte la accesibilidad de la cromatina en neuronas cultivadas hasta cierto punto, una posibilidad que justifica una mayor investigación. Dado que CHD8 se une a la región promotora de los genes dependientes de la actividad, puede promover la accesibilidad a la cromatina en los elementos reguladores de estos genes y, por lo tanto, facilitar su transcripción dependiente de la actividad. Se necesitarán más estudios para aclarar los mecanismos detallados de la regulación transcripcional por CHD8.

La haploinsuficiencia CHD8 es un factor de riesgo altamente penetrante para el TEA, y la mutación heterocigótica de Chd8 confiere fenotipos conductuales similares al TEA en ratones7,12,13,14,15,16,17. Algunas personas con TEA asociado con la mutación CHD8 experimentan convulsiones7, mientras que no detectamos un cambio en la susceptibilidad a las convulsiones en ratones Chd8 CKO. El comportamiento social anormal, como un aumento del tiempo total de contacto durante la prueba de interacción social recíproca, es una de las características conductuales reproducibles de los ratones mutantes Chd812,13,16,17,21. Los ratones Chd8 CKO hembras, pero no machos, en el presente estudio mostraron un comportamiento social alterado, lo que sugiere un fenotipo sexualmente dimórfico15. Además, los ratones macho Chd8 CKO manifestaron un aumento del comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto, pero no en la prueba del laberinto en cruz elevado y la prueba de transición de luz a oscuridad. La ansiedad es uno de los síntomas de las personas con TEA1,7 y los ratones mutantes heterocigotos Chd8 también manifiestan un comportamiento similar a la ansiedad12,13. Nuestros resultados sugieren que CHD8 en el cerebro adulto puede contribuir al control del comportamiento social y el comportamiento similar a la ansiedad.

Los fenotipos conductuales sexualmente dimórficos se han observado previamente en ratones modelo ASD, incluidos los ratones mutantes Chd815. Dado que las hormonas sexuales y los cromosomas sexuales están implicados en las diferencias sexuales en el comportamiento34, es posible que la deleción de Chd8 altere los niveles de hormonas sexuales o la expresión de sus receptores. Los antecedentes genéticos, la edad y las diferencias de mutación también pueden influir en los resultados conductuales sexualmente dimórficos35,36.

Utilizamos la línea de ratón CAG-CreER para lograr la eliminación de Chd8 inducible por tamoxifeno en neuronas posmitóticas de ratón in vitro y en el cerebro adulto in vivo. Dado que esta línea impulsa la recombinación en todos los tipos de células, en lugar de mostrar la especificidad del tipo de célula, la eliminación de Chd8 no solo en las neuronas posmitóticas sino también en las células gliales y otras poblaciones celulares podría influir en los cambios transcriptómicos, epigenéticos y de comportamiento observados en este estudio. Se justifican más estudios para determinar si estos cambios son atribuibles a alteraciones en las neuronas posmitóticas.

Se demostró previamente que CHD8 tiene funciones sensibles a la dosis en la regulación transcripcional y los fenotipos conductuales33,37. Dado que la eliminación homocigota de Chd8 en el cerebro adulto dio lugar a alteraciones transcripcionales y algunos déficits de comportamiento en el presente estudio, también es posible que la mutación heterocigota de Chd8 pueda conferir efectos similares pero menos pronunciados. En conjunto, los hallazgos actuales revelan un papel para CHD8 en la regulación transcripcional dependiente de la actividad en las neuronas posmitóticas y el cerebro adulto y, por lo tanto, brindan información potencialmente importante sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la patogénesis del TEA.

La generación de ratones Chd8F/F se describió previamente12. Se cruzaron ratones Chd8F/F con ratones heterocigotos CAG-CreER para producir ratones CAG-CreER/Chd8F/F24. Para la inducción de la recombinación mediada por Cre in vivo, se inyectó por vía intraperitoneal a ratones CAG-CreER/Chd8F/F de 8 a 12 semanas de edad durante cinco días consecutivos tamoxifeno (2 mg por ratón) disuelto en aceite de maíz. El tratamiento múltiple con tamoxifeno da como resultado una eliminación más eficiente de los alelos floxados en comparación con un solo tratamiento38. Los ratones se genotipificaron mediante análisis de ADN genómico basado en PCR con cebadores para Chd8 (5′-CCCAAAAGACCAAATCAAACAAAC-3′, 5′-CCATAGGCTGAAGAACCGTAATTG-3′ y 5′-AGGCTTAGAAACCCGTCGAG-3′) y Cre (5′-AGGTTCGTTCACTCATGGA-3 ′ y 5′-TCGACCAGTTTAGTTACCC-3′). Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Kanazawa.

Las neuronas primarias se aislaron del hipocampo de ratones machos y hembras en E18.5 como se describió anteriormente, pero con modificaciones menores23,39. La generación de neuronas piramidales está casi completa en esta etapa, y el aislamiento de neuronas a partir de tejido embrionario tiene la ventaja de que el tejido se disocia más fácilmente y de que se minimiza la contaminación con células gliales y fibroblastos. En resumen, el tejido se incubó durante 20 min a 37 °C con 0,25 % de tripsina-EDTA y DNasa (047-26771, Wako) a 25 µg/ml, y se sometió a una suave disociación mediante el paso repetido a través de una pipeta Pasteur después de la adición de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y ADNasa (10 µg/ml). Las células disociadas se pasaron a través de un filtro de células de 40 μm, se recogieron por centrifugación y se transfirieron a una placa recubierta con poli-d-lisina (P6407, Sigma-Aldrich) para su cultivo a 37 °C en medio neurobasal suplementado con MACS NeuroBrew-21. suplemento (130-097-263, Miltenyi Biotec) a 20 ml/l, L-glutamina 2 mM (25030081, Thermo Fisher Scientific) y penicilina-estreptomicina (15140122, Thermo Fisher Scientific) a 10 ml/l. Después de 2 días in vitro (DIV), los cultivos se trataron con Ara-C 1 µM durante 24 h para eliminar todas las células en división. Para la inducción de la recombinación in vitro mediada por Cre, las neuronas se incubaron durante 24 h en presencia de 4-OHT 500 µM a 4 DIV. Para la despolarización neuronal inducida por KCl, se añadieron al medio de cultivo tetrodotoxina 1 µM (Wako) y D-AP5 100 µM (Tocris Bioscience) a 9 DIV para reducir la actividad neuronal y luego las neuronas se trataron con 5 o 55 mM KCl durante 2 h añadiendo tampón de control (KCl 5 mM, NaCl 165 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8 mM, HEPES 11 mM) o tampón de despolarización (KCl 170 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8 mM, HEPES 11 mM) hasta una dilución final de 32,4% a 10 DIV.

Los anticuerpos policlonales de conejo contra CHD8 se generaron internamente y se usaron para el análisis de inmunotransferencia. Otros anticuerpos incluyeron los de TUBB3 (ab78078, Abcam, 1:500), los de GFAP (IR524, DAKO, 1:500) y los de Olig2 (AB9610, Millipore, 1:500) para la tinción de inmunofluorescencia, los de FOSB (ab184938, Abcam, 1:2000) y HSP90 (610419, BD Biosciences, 1:2000) para análisis de inmunotransferencia, y H3K4me3 (ab8580, Abcam, 2 µg por muestra) y ARN polimerasa II (91151, Active Motif, 2 µg por muestra) para ChIP.

La tinción de inmunofluorescencia se realizó como se describió previamente21. Las células cultivadas se fijaron durante la noche a 4 °C con paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se expusieron a albúmina sérica bovina al 2 % y Triton X-100 al 0,3 % en PBS y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con solución salina tamponada con fosfato (PBS). anticuerpos Los inmunocomplejos se detectaron con anticuerpos secundarios de cabra conjugados con Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 546 (Thermo Fisher Scientific). El ensayo TUNEL (etiquetado terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick-end) se realizó con el uso de un MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct (8445, MBL). Todas las células se contrastaron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y las imágenes se adquirieron con un microscopio BZ-X800 (Keyence). Se aplicó el software ImageJ para contar el número de cada tipo de célula o células apoptóticas.

El ARN total (500 ng) aislado de neuronas cultivadas o del hipocampo con el uso del reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific) se sometió a RT con una mezcla de ReverTra Ace RT con eliminador de gDNA (Toyobo). El ADNc resultante se sometió a un análisis de PCR en tiempo real con el uso de Luna Universal qPCR Master Mix (M3003, New England Biolabs) y cebadores específicos en un Thermal Cycler Dice Real Time System III (Takara Bio). Los datos se normalizaron por la abundancia de ARNm de Rplp0 o Gapdh. Los cebadores de PCR (sentido y antisentido, respectivamente) fueron los siguientes: Rplp0, 5′-GGACCCGAGAAGACCTCCTT-3′ y 5′-GCACATCACTCAGAATTTCAATGG-3′; Gapdh, 5′-GCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′ y 5′-GAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3′; Chd8L, 5′-TCCCTTTTGGTCATTGCTC-3′ y 5′-TTCAGCCTATGGGCTTCATC-3′; Fosb, 5′-TTTTCCCGGAGACTACGACTC-3′ y 5′-GTGATTGCGGTGACCGTTG-3′; Nr4a1, 5′-TTGAGTTCGGCAAGCCTACC-3′ y 5′-GTGTACCCGTCCATGAAGGTG-3′; y Egr1, 5′-TCGGCTCCTTTCCTCACTCA-3′ y 5′-CTCATAGGGTTGTTCGCTCGG-3′.

Los extractos de proteínas totales se prepararon a partir de neuronas cultivadas o del hipocampo y se sometieron a análisis de inmunotransferencia como se describió anteriormente40. Se aplicó el software ImageJ para medir la intensidad de la señal de cada proteína.

El ARN total se extrajo de las neuronas tratadas con KCl 5 o 55 mM con el uso del reactivo TRIzol. El ARN mensajero (1 μg) purificado del ARN total con el uso de un módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly (A) (New England Biolabs) se usó para preparar una biblioteca de ADNc con el uso de un kit de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina (New England Biolabs), y luego se secuenció cada biblioteca con el uso de un sistema NovaSeq 6000 (Illumina). La calidad de los datos de secuenciación sin procesar se verificó con FastQC (versión 0.11.9), y el recorte de las secuencias del adaptador se realizó con Trimmomatic (versión 0.39)41. La cantidad total de cada ARNm se calculó con el uso de una serie de programas que incluyen HISAT2 (versión 2.1.0)42, featureCounts (versión 2.0.0)43 y DESeq2 (versión 1.26.0)44. Las lecturas de RNA-seq se mapearon contra el genoma del ratón (mm10). GSEA se realizó como se describió anteriormente con el uso del software GSEA versión 4.2.145. Para la GSEA se usó un conjunto de genes cuya expresión se incrementó significativamente (log2 (cambio de pliegue) de >2,0 asociado con un valor de P ajustado por FDR de <0,01) en neuronas de control tratadas con KCl 55 mM en relación con las tratadas con KCl 5 mM . El análisis GO de genes expresados ​​diferencialmente (FDR q < 0,05) se realizó con el uso de DAVID46 y SynGO47.

Las bibliotecas ATAC-seq se prepararon con el uso de un kit ATAC-Seq (Active Motif). Chd8 CKO y neuronas de control aisladas de ratones macho se trataron con KCl 5 o 55 mM durante 2 h y luego se incubaron durante 30 min a 37 °C en medio de cultivo que contenía DNasa (15 µg/ml). A continuación, las neuronas se disociaron de la placa de cultivo mediante exposición a tripsina-EDTA al 0,25 %. El hipocampo se disoció manualmente del cerebro de ratones de cada genotipo con una etapa de convulsión similar a los 60 min después del tratamiento con KA o vehículo. Los núcleos se extrajeron de las células cultivadas o del hipocampo con el uso de ATAC Lysis Buffer, y se usaron 1 × 105 núcleos para preparar cada biblioteca ATAC-seq. Las bibliotecas se secuenciaron con el uso de un sistema HiSeq 2500 (Illumina). Las lecturas se asignaron de forma única al genoma del ratón (mm10) con el uso del software Bowtie (versión 2.2.3)48, y las lecturas duplicadas se eliminaron con samtools (versión 1.9)49. Los archivos BAM de dos réplicas para cada condición se fusionaron con samtools. Regiones marcadamente enriquecidas del genoma fueron identificadas con el uso de MACS pico llamador (versión 2.1.1, con la opción "-p 1e-5 --gsize mm --nomodel --extsize 160")50. El mapa de calor y los perfiles de densidad se generaron con plotHeatmap en deepTools (3.5.0)51.

ChIP se realizó esencialmente como se describió previamente21. Las neuronas cultivadas tratadas con KCl 55 mM durante 2 h se fijaron mediante incubación durante 10 min en hielo con paraformaldehído al 0,5 % en tampón ChIP (HEPES-KOH 5 mM (pH 8,0), KCl 200 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1,5 mM, 5 % sacarosa, 0,5% Nonidet P-40) suplementado con un cóctel inhibidor de proteasas (Wako), sometido a tratamiento ultrasónico y digerido con nucleasa microcócica durante 40 min a 30 °C. Después de la adición de EDTA a una concentración final de 0,1 mM, cada muestra digerida se centrifugó a 15.000 × g durante 10 min a 4 °C, y el sobrenadante resultante se incubó con rotación durante 6 h a 4 °C con anticuerpos conjugados con magnético. rosario. Las proteínas unidas se eluyeron de las perlas y los enlaces cruzados se revirtieron mediante incubación durante la noche a 65 °C con SDS al 1 % en tampón Tris-EDTA. Después de lavar dos veces con tampón ChIP y con tampón Tris-EDTA, el ADN se purificó con el uso de Nucleo Spin Gel y PCR Clean-Up (Takara Bio) y se sometió a análisis de PCR en tiempo real como se describe anteriormente. Los cebadores de PCR (sentido y antisentido, respectivamente) fueron los siguientes: Egr3 TSS, 5′-GGAAGGCTTGGTTGGAGAC-3′ y 5′-GCACCTACCTCCCTCCAGTC-3′; Fosb TSS, 5′-AGCCTGGACTTTCAGGAGGT-3′ y 5′-GCTCGGGGAAGCTTAGTCTC-3′; Nr4a1 TSS, 5′-AACCTGCACTGGGGTATCAC-3′ y 5′-GACAAAGCTTGGCTTCCTTG-3′; Homer1 TSS, 5′-GCCTTTAGGAGGGGAGAAAG-3′ y 5′-GGGGAAAACCACCGTTAAT-3′; y Homer1 aguas arriba, 5′-TCTGCCACCTCATTTCTGCT-3′ y 5′-TAGCACACACAGGCCATCAT-3′.

Los datos de ChIP-seq obtenidos previamente con anticuerpos contra CHD8 (DRA003116) se volvieron a analizar como se describe en el estudio original12. En resumen, las lecturas se asignaron de forma única al genoma del ratón (mm10) con el uso del software Bowtie (versión 2.2.3)48, y las lecturas duplicadas se eliminaron con samtools (versión 1.9)49. Regiones marcadamente enriquecidas del genoma fueron identificadas con el uso de MACS pico llamador (versión 2.1.1, con la opción "-p 1e-5 --gsize mm --nomodel --extsize 160")50.

Se inyectó por vía intraperitoneal KA (25 mg/kg) disuelto en PBS a ratones macho de 16 a 18 semanas de edad y ratones hembra de 13 a 18 semanas de edad. La inducción de convulsiones por KA es uno de los modelos más comúnmente estudiados de epilepsia del lóbulo temporal52. Las convulsiones conductuales se observaron durante 1 hora después de la inyección y se puntuaron de acuerdo con los criterios descritos anteriormente53: etapa 0, comportamiento normal; etapa 1, inmovilidad y rigidez; etapa 2, movimiento de la cabeza; etapa 3, clonus de miembros anteriores y crianza; etapa 4, crianza y caída continuas; etapa 5, convulsión clónico-tónica; Etapa 6, muerte. A continuación, se extrajo el hipocampo, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a –80 °C para el análisis de la expresión génica. Se usaron ratones con una etapa de ataque de 3 a 5 para el análisis de expresión génica y el análisis ATAC-seq.

Los ratones Chd8 CKO o de control se alojaron en grupo en una habitación con un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad (las luces se encienden a las 8:00 am) y con acceso a comida y agua ad libitum. Se realizaron pruebas de comportamiento con ratones machos y hembras entre las 11 y las 18 semanas de edad y entre las 9:00 am y las 6:00 pm como se describió anteriormente19. Cada aparato se limpió con una solución diluida de hipoclorito de sodio antes de probar cada animal para evitar sesgos debido a las señales olfativas. Las pruebas de comportamiento incluyeron la prueba del laberinto acuático de Morris, la prueba de campo abierto, la prueba de transición de la luz a la oscuridad, la prueba del laberinto en cruz elevado, la prueba de aseo personal, la prueba de interacción social en un entorno novedoso y las pruebas de preferencia de sociabilidad y novedad social. Todas las pruebas fueron realizadas por experimentadores bien capacitados utilizando sistemas de análisis automatizados como se describe a continuación. Los experimentadores siempre estaban cegados al genotipo del ratón para excluir sesgos en las mediciones de comportamiento.

Para los ensayos de plataforma visible y oculta de la prueba del laberinto acuático de Morris, se llenó una piscina de plástico circular (120 cm de diámetro) hasta una profundidad de 30 cm con agua (mantenida a 21° ± 1,0 °C) que había sido coloreada de blanco por la adición de pintura no tóxica54. Una plataforma de escape circular transparente (9 cm de diámetro) se sumergió en el centro de uno de los cuadrantes de la piscina con su superficie ubicada ~1 cm por debajo de la del agua. Las señales visuales que diferían en forma geométrica y color se distribuyeron alrededor de la piscina. Ratones machos de entre 11 y 15 semanas de edad y ratones hembra de entre 11 y 16 semanas de edad fueron sometidos inicialmente a la tarea de plataforma visible, en la que se marcaba la plataforma con una bandera. Al día siguiente, se retiró la bandera y se realizaron las tareas de la plataforma oculta durante cuatro días consecutivos. El ratón se colocó al azar en la piscina frente a la pared en cada uno de los cuatro cuadrantes. Cada tarea constaba de cuatro intentos por día con un tiempo de corte de 60 s. Si el ratón alcanzaba la plataforma de destino, se le permitía permanecer en la plataforma durante >15 s. Si el ratón no encontraba la plataforma dentro de los 60 s, se lo guiaba suavemente hacia ella y luego se dejaba allí durante >15 s. El sexto día, se retiró la plataforma de la piscina y se realizó una prueba de sondeo para evaluar la memoria de la ubicación anterior de la plataforma. Se permitió que los ratones nadaran en la piscina durante 60 s y se midió el tiempo que pasaban en cada cuadrante. La locomoción del ratón se registró con una cámara de video y se analizó automáticamente con el software SMART Video Tracking (Panlab).

Cada ratón macho de 14 a 16 semanas de edad o ratón hembra de 12 a 17 semanas de edad se colocó en la esquina de un aparato de campo abierto (50 por 50 por 40 cm, O'Hara & Co.), que estaba iluminado a 100 lux. La distancia total recorrida y el tiempo pasado en el área central (25 por 25 cm) se registraron durante 10 min. La locomoción del ratón se registró con una cámara de video controlada con un programa personalizado en LabVIEW y se analizó automáticamente con un software interno escrito en Python.

El aparato constaba de dos brazos abiertos (25 por 5 cm) y dos brazos cerrados del mismo tamaño con paredes transparentes de 15 cm de alto (O'Hara & Co.). Los brazos y la plaza central estaban hechos de placas de plástico blanco y estaban elevados a una altura de 50 cm sobre el piso. La probabilidad de que los animales cayeran del aparato se minimizó mediante la presencia de salientes de plástico de 3 mm de altura en los brazos abiertos. Los brazos del mismo tipo estaban dispuestos en lados opuestos. Cada ratón macho de 15 a 17 semanas de edad o hembra de 12 a 17 semanas de edad se colocó en el cuadrado central del laberinto (5 por 5 cm) frente a uno de los brazos cerrados, y se registró su comportamiento durante 10 min. . La locomoción del ratón se registró con una cámara de video controlada con un programa hecho a la medida en LabVIEW, y el tiempo pasado en los brazos abiertos se midió automáticamente con un software interno escrito en Python.

El aparato consistía en una jaula (21 por 42 por 25 cm) que estaba dividida en dos secciones de igual tamaño por un tabique con una puerta (O'Hara & Co.). Una cámara estaba hecha de plástico blanco y brillantemente iluminada (390 lux), mientras que la otra era negra y oscura (2 lux). Se colocaron ratones macho de 14 a 17 semanas de edad o ratones hembra de 12 a 17 semanas de edad en el lado oscuro y se les permitió moverse libremente entre las dos cámaras con la puerta abierta durante 10 min. La locomoción del ratón se registró con una cámara de video controlada con un programa hecho a medida en LabVIEW, y el tiempo pasado en cada cámara se midió automáticamente con un software interno escrito en Python.

La prueba de aseo se realizó como se describió previamente12. Cada ratón macho de 11 a 16 semanas de edad o ratón hembra de 13 a 18 semanas de edad se colocó individualmente en una nueva jaula estándar. Después de la habituación durante 10 minutos, se grabó en video al animal durante un período de prueba de 10 minutos y se determinó el tiempo empleado en acicalarse.

Se colocaron juntos dos ratones de 15 a 17 semanas de edad para machos y de 12 a 17 semanas de edad para hembras y del mismo genotipo que habían sido alojados previamente en grupos de genotipos mixtos (tres o cuatro animales por jaula) y en jaulas diferentes en una caja (50 x 50 x 40 cm, O'Hara & Co.) y se deja explorar libremente durante 10 min. Las imágenes se capturaron a una velocidad de tres fotogramas por segundo y el análisis se realizó automáticamente con un software interno escrito en Python. Se midió el número total de contactos y la duración total de los contactos.

El aparato de prueba consistía en una caja rectangular de tres cámaras (O'Hara & Co.). Cada cámara tenía 20 por 40 por 30 cm y las paredes divisorias estaban hechas de plexiglás transparente, con pequeñas aberturas (6 cm) que permitían el acceso a cada cámara. Un ratón desconocido del mismo sexo (extraño 1) que no había tenido contacto previo con el ratón sujeto se colocó en una de las cámaras laterales. La ubicación del extraño 1 en la cámara izquierda frente a la derecha se alternó sistemáticamente entre los ensayos. El extraño ratón estaba encerrado en una pequeña jaula de alambre redonda que permitía el contacto de la nariz entre las barras pero evitaba la pelea. La jaula tenía 10 cm de altura, con un diámetro inferior de 10 cm y barras verticales separadas 0,5 cm. Se colocó una jaula vacía idéntica en la otra cámara lateral. El ratón sujeto se colocó primero en la cámara central y se le permitió explorar toda la caja de prueba social durante 10 min. La cantidad de tiempo pasado alrededor de cada jaula y en cada cámara se midió con la ayuda de una cámara para cuantificar la preferencia social por el extraño 1. Luego se colocó un segundo ratón desconocido del mismo sexo (extraño 2) en la jaula vacía. Por lo tanto, el ratón de prueba tenía la opción de elegir entre el primer ratón desconocido ya investigado (extraño 1) y el nuevo ratón desconocido (extraño 2). La cantidad de tiempo pasado alrededor de cada jaula y en cada cámara durante una segunda sesión de 10 minutos se midió como antes. Se usaron ratones C57BL/6J como ratones extraños, y los ratones macho y hembra usados ​​en estas pruebas tenían de 16 a 18 semanas o de 13 a 17 semanas de edad, respectivamente. La locomoción del ratón se registró con una cámara de video controlada con un programa personalizado en LabVIEW y se analizó automáticamente con un software interno escrito en Python.

Los datos cuantitativos se presentan como media ± sem o como se indica, y también se indica el número de ratones sometidos a cada experimento. El análisis estadístico mediante la prueba t de Student para datos no apareados, la prueba t de Student para datos apareados, el análisis de varianza (ANOVA) unidireccional con la prueba post hoc de Tukey, ANOVA factorial bidireccional o ANOVA repetido bidireccional se realizó con el uso del lenguaje R . Los niveles de significación para los valores de P y FDR q se indican mediante *, **, *** y **** para <0,05, <0,01, <0,001 y <0,0001, respectivamente.

Los datos de origen subyacentes a todos los gráficos están disponibles en Datos complementarios 2. Los datos están disponibles poniéndose en contacto con el autor correspondiente. Las imágenes sin recortar de las inmunotransferencias se muestran en la figura complementaria 8. Los datos de RNA-seq y ATAC-seq se han depositado en el archivo de lectura de secuencias (DRA) de DDBJ con los números de acceso DRA014131, DRA016165 y DRA016198.

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Los autores agradecen a M. Asamura, H. Kobayashi y C. Tambo por su asistencia técnica general; A. Toyoda (Instituto Nacional de Genética) por la asistencia técnica con el análisis de RNA-seq y ATAC-seq; K. Ono, T. Hamaguchi y D. Muramatsu por el uso del equipo para la prueba del laberinto acuático de Morris; T. Miyamoto por su asistencia general y discusión; y miembros del laboratorio para la discusión. AK fue apoyado por una beca de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS). Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones KAKENHI de JSPS y el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón a MN (JP21H02847 y 16H06279 (PAGS)) y a AK (JP21K15726, JP21H05619 y 22H05493) también como por una subvención PRIME de la Agencia de Japón para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) a MN (JP22gm6310008).

Departamento de Histología y Biología Celular, Facultad de Posgrado en Ciencias Médicas, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Ishikawa, 920-8640, Japón

Atsuki Kawamura y Masaaki Nishiyama

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AK diseñó y realizó experimentos, analizó datos y preparó el manuscrito. MN contribuido a la supervisión del estudio y redacción del manuscrito.

Correspondencia a Masaaki Nishiyama.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Konstantinos Zarbalis y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Joao Valente. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Kawamura, A., Nishiyama, M. La eliminación del gen Chd8 relacionado con el autismo altera las respuestas transcripcionales dependientes de la actividad en las neuronas postmitóticas del ratón. Commun Biol 6, 593 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

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Recibido: 17 junio 2022

Aceptado: 23 de mayo de 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

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