Noticias

Aug 06, 2023

PEG2000

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 10564 (2022) Citar este artículo

1208 Accesos

2 citas

1 Altmetric

Detalles de métricas

Dado nuestro interés en la utilidad de los liposomas para la obtención de imágenes moleculares y la teranóstica, investigamos cómo el recubrimiento de la capa externa del liposoma afecta la internalización por parte de las líneas celulares de cáncer de mama in vitro y en los tejidos tumorales de mama in vivo. De hecho, descubrimos que se puede lograr una captación liposomal notablemente alta mediante un recubrimiento blando de DBCO (dibenzociclooctino). Nuestros datos demuestran que decorar el lípido terminal con un resto DBCO a una densidad específica induce una mayor captación tumoral in vivo (captación tumoral ~ 50 %) en comparación con el liposoma no decorado convencional (captación tumoral ~ 20 %). En este estudio, informamos una visualización mejorada de las células de cáncer de mama in vivo utilizando un modelo de cáncer de mama ortotópico 4T1 y modelos de xenoinjerto de tumor de mama primario MDA-MB-231 y MDA-MB-436. Los liposomas recubiertos con L-PEG2000-DBCO demuestran una mayor acumulación en las células de cáncer de mama independientemente del tamaño del tumor, el tipo, la posición, la expresión del receptor y la condición de los ratones huéspedes. Esperamos que estos hallazgos tengan un gran impacto positivo en la utilidad práctica de los liposomas en aplicaciones guiadas por imágenes y teranóstica de medicina de precisión.

Los liposomas son vesículas lipídicas que consisten en una bicapa lipídica que encapsula un núcleo acuoso y se consideran entre los vehículos de administración de fármacos más prometedores y eficaces1,2. Los liposomas se han estudiado ampliamente durante las últimas tres décadas para optimizar su potencial clínico. Entre las aplicaciones más exitosas de los liposomas en la administración de fármacos se encuentran las dos formulaciones de doxorrubicina liposomal (Doxil, Myocet) aprobadas para uso clínico en cáncer de ovario y mieloma múltiple, entre otras enfermedades3,4,5. Sin embargo, a pesar de estos éxitos terapéuticos, el desarrollo clínico de los liposomas en la formación de imágenes moleculares y en la teranóstica guiada por imágenes está sustancialmente más retrasado. Hasta el momento, la principal limitación a superar es la captación liposomal relativamente baja por parte de los tejidos tumorales. Existe una necesidad insatisfecha de nuevas formulaciones liposomales que puedan facilitar una alta captación tumoral para facilitar la traducción clínica de estos sorprendentes nanoportadores.

Las modificaciones de la superficie permiten el diseño personalizado de liposomas para aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y de entrega guiada por imágenes6,7,8,9,10,11. Las ventajas únicas de los liposomas incluyen una reactividad inmunitaria mínima, una degradación proteolítica reducida, tiempos de circulación aumentados y ensamblaje reproducible de una manera rentable. Como resultado, los liposomas son herramientas nanoportadoras casi mágicas para el diagnóstico, seguimiento y manejo de enfermedades humanas12,13.

Dado nuestro interés en el desarrollo clínico de liposomas para la teranóstica de imágenes moleculares, investigamos cómo el recubrimiento de la capa externa del liposoma con una densidad de superficie específica afecta la internalización celular in vitro e in vivo. De hecho, descubrimos que se puede lograr una absorción liposomal notablemente alta por parte de los tejidos tumorales in vitro e in vivo mediante el recubrimiento blando de DBCO (dibenzociclooctino). Nuestros datos muestran que decorar el lípido terminal con un resto DBCO a una densidad específica produce una captación tumoral profunda in vivo (~ 50 %) en comparación con el liposoma no decorado tradicional (captación tumoral ~ 20 %). En un modelo animal, pudimos visualizar una mayor captación por células de cáncer de mama ortotópicas 4T1 y xenoinjertos de líneas celulares de cáncer de mama primario MDA-MB-231 y MDA-MB-436. Nuestros hallazgos son consistentes con hallazgos recientes de que las interacciones entre la superficie liposomal y la membrana celular influyen significativamente en la absorción celular. Una mejor comprensión de cómo la superficie liposomal regula las vías de internalización celular presenta una oportunidad para mejorar la administración intracelular de fármacos14.

Nuestros hallazgos allanarán el camino para el desarrollo de la próxima generación de liposomas con propiedades superficiales modificadas que faciliten la captación eficiente del tumor y, a su vez, demostrarán un inmenso potencial para el uso clínico en la teranóstica de la medicina de precisión. Esperamos aprovechar las ventajas de estos liposomas mejorados para la cirugía guiada por imágenes de precisión, la detección precisa de tumores con radiotrazadores de tomografía por emisión de positrones (PET) y el tratamiento de tumores a través de la entrega precisa de carga útil radioterapéutica al tumor primario y sus metástasis distantes. Estos ambiciosos estudios están en curso en nuestro laboratorio y se publicarán a su debido tiempo.

Los liposomas se ensamblaron como se ilustra en la Fig. 1a siguiendo estos pasos: los lípidos del esqueleto (DOPC), los lípidos funcionales (DSPE-PEG2000-DBCO o DSPE-PEG2000) y los materiales de imagen (DiI o DiR) se disolvieron en cloroformo y formaron el película delgada seguida de rehidratación, extrusión y diálisis. El tamaño y el potencial zeta fueron ~ 95 nm y − 4,8 mV respectivamente (Tabla S1). Se tomaron imágenes de la morfología de la superficie L-PEG2000-DBCO mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) como se muestra en la Fig. 1b. El diámetro de L-PEG2000-DBCO (L-DBCO) fue de aproximadamente 96 nm con una distancia de 25 Å entre terminales DBCO adyacentes (Fig. 1b y Tabla S1).

Ensamblaje de L-PEG2000-DBCO con densidad de DBCO deseable: (a) esquema del procedimiento de ensamblaje liposomal y (b) se tomaron imágenes de la morfología de la superficie de L-PEG2000-DBCO mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y la matriz de recubrimiento DBCO se representa mediante un esquema de cartón para mostrar la estructura potencial de la morfología de la superficie L-PEG2000-DBCO.

Utilizamos citometría de flujo y microscopía confocal in vitro para demostrar que L-PEG2000-DBCO es superior al L-PEG2000 convencional. Como se esperaba, no se observaron diferencias significativas en la captación celular mediante citometría de flujo entre L-PEG2000 (marcado con DiI) y L-PEG2000-DBCO (marcado con DiI) en la línea celular no neoplásica (Vero) como se muestra en la Fig. 2a. Por el contrario, L-PEG2000-DBCO mostró una mayor absorción celular en las células de cáncer de mama: MCF-7, MDA-MB-231 y MDA-MB-436, como se muestra en la Fig. 2b-d. El valor medio de los picos de DiI, L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO para diferentes células se enumeran en la Tabla S1 (material complementario). La intensidad de la señal de la tinción con L-PEG2000-DBCO aumentó un 258 %, 303 % y 255 % en MCF-7, MDA-MB-231 y MDA-MB-436 respectivamente en comparación con L-PEG2000. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que ambas formulaciones liposomales (marcadas con DiI) distinguen las células normales de las células de cáncer de mama y L-PEG2000-DBCO es superior para acumularse en células de cáncer de mama en comparación con L-PEG2000. Además, utilizamos microscopía confocal para confirmar aún más nuestros hallazgos. La intensidad de tinción de L-PEG2000-DBCO aumentó un 244 % en las células MDA-MB-231 en relación con L-PEG2000, como se muestra en la Fig. 2e.

Estudios de citometría de flujo y microscopía confocal utilizando formulaciones liposomales marcadas con DiI (excepto que el falso representa medio de cultivo): (a) línea celular no neoplásica (Vero), (b) línea celular de tumor primario Her2/neu+ (MCF-7), ( c) Línea celular de cáncer de mama triple negativo (TNBC) (MDA-MB-231), (d) Línea celular de cáncer de mama triple negativo (TNBC) con alto potencial metastásico (MDA-MB-436) y (e) Microscopía confocal de células liposomales formulaciones en líneas celulares MDA-MB-231.

Utilizamos imágenes ópticas in vivo para confirmar y desarrollar aún más los datos in vitro anteriores. Probamos el rendimiento de L-PEG2000-DBCO y L-PEG2000 en un tumor ortotópico pequeño (15 ~ 25 mm3) para imitar los focos metastásicos o los focos de recaída después de la resección quirúrgica16,17. Se informó que el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica de las células 4T1 en ratones BALB/c imitan el cáncer de mama humano en estadio IV18. De hecho, los datos que se muestran en la Fig. 3a-c demuestran una captación tumoral superior de L-PEG2000-DBCO en comparación con el liposoma L-PEG2000. El L-PEG2000-DBCO muestra una captación notablemente alta en los focos tumorales, de hasta un 54 %, mientras que la captación en el hígado se limitó al 16 %. Por el contrario, el L-PEG2000 no pudo detectar este pequeño tumor con el 77% del liposoma atrapado por el hígado y el sistema ER (Fig. 3c, d). La tasa de acumulación de las dos formulaciones liposomales en los tejidos tumorales se ilustra en la Fig. 3c, d. En general, el L-PEG2000-DBCO mostró un 700 % más de acumulación de tumores que el L-PEG2000.

Detección de pequeños focos de cáncer de mama alogénico (4T1 con tamaño de tumor de 15 ~ 25 mm3) con L-PEG2000-DBCO. ( a, b ) comparación lado a lado de la absorción tumoral obtenida por ( a ) L-PEG2000 y ( b ) L-PEG2000-DBCO; (c) evolución temporal de la biodistribución de L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO en el tumor durante 120 h y (d) evolución temporal de la biodistribución de L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO en el hígado durante 120 h.

Además, una segunda administración liposomal después de 96 h no provocó un aclaramiento sanguíneo acelerado. Se ha informado que la administración repetida de sustancias conjugadas con PEG, incluidos los liposomas PEGilados, puede causar una respuesta inmunogénica que da como resultado un mayor aclaramiento y una eficacia reducida de las sustancias conjugadas con PEG/nanoportadores PEGilados19,20,21.

Ampliamos más los estudios a otros xenoinjertos de cáncer de mama y confirmamos aún más la capacidad de L-PEG2000-DBCO para detectar xenoinjertos de tumores breact. Como se muestra en la Fig. 4, L-PEG2000-DBCO se acumuló con alta concentración en MCF-7 (211 mm3), MDA-MB-231 (507 mm3) y MDA-MB-436 (232 mm3) xenoinjertos de tumor breact.

Imágenes ópticas de xenoinjertos de cáncer de mama con L-PEG2000-DBCO: MCF-7 (211 mm3), MDA-MB-231 (507 mm3) y MDA-MB-436 (232 mm3).

Luego extirpamos los tejidos hepáticos y tumorales de los ratones con xenoinjerto tumoral MDA-MB-231 y realizamos imágenes ópticas ex vivo y microscopía confocal. Los resultados también fueron consistentes con los datos anteriores que confirman la superioridad de L-PEG2000-DBCO sobre L-PEG2000. Como se muestra en la Fig. 5, L-PEG2000-DBCO superó a L-PEG2000 en más de tres veces en el tumor y acumuló un 40 % menos en el hígado (Fig. 5b,c). Además, la microscopía confocal también demostró una mayor captación tumoral y una menor captación de L-PEG2000-DBCO en comparación con L-PEG2000 (Fig. 5d). En conjunto, los resultados in vivo y ex vivo respaldan firmemente el alto rendimiento de L-PEG2000-DBCO al acumularse con una alta concentración en tejidos tumorales, lo que subraya el inmenso potencial de utilidad de L-PEG2000-DBCO como un poderoso nanoportador de varios aplicaciones de imágenes y guiadas por imágenes.

Imágenes ópticas ex vivo y microscopía confocal con L-PEG2000-DBCO y L-PEG2000 en tejidos tumorales e hígado de xenoinjerto tumoral MDA-MB-231: (a) experimento de control para demostrar la misma intensidad de fluorescencia de L-PEG2000 y L-PEG2000- DBCO, (b) imágenes ópticas ex vivo con L-PEG2000-DBCO y L-PEG2000 en tejidos tumorales y el hígado, (c) absorción cuantitativa basada en la intensidad de la señal fluorescente de L-PEG2000-DBCO y L-PEG2000 en tejidos tumorales y el hígado a las 24 h después de la administración de liposomas y ( d ) imágenes de microscopía confocal de L-PEG2000-DBCO y L-PEG2000 en tejido tumoral y secciones de hígado.

Para finalizar y fortalecer nuestros hallazgos, examinamos la utilidad de L-PEG2000-DBCO in vivo para demostrar la notable capacidad de L-PEG2000-DBCO para visualizar tumores pequeños. De hecho, L-PEG2000-DBCO pudo detectar un pequeño tumor de mama subcutáneo (MDA-MB-231, tamaño 10 ~ 20 mm3) que era invisible tanto a simple vista como en el campo brillante, como lo indican las flechas en la Fig. 6a,b . Es importante tener en cuenta que el pequeño tumor está implantado en la almohadilla de grasa y, por lo tanto, fue difícil aislarlo del tejido paracanceroso. Como resultado, el tamaño del tumor en la Fig. 6b parece ser mayor que el tamaño exacto del tumor sólido medido con el calibrador (la fotografía se muestra en la Figura S4). Además, la Fig. 6b indica que nuestro L-PEG2000-DBCO tiene una gran capacidad de focalización tanto en el tejido canceroso como en el tejido paracanceroso, ya que la señal del tejido paracanceroso se muestra en la Fig. 6b. Además, L-PEG2000-DBCO fue superior a L-PEG2000 en xenoinjertos tumorales de mayor tamaño, como se muestra en la Fig. 6b. Las imágenes ópticas ex vivo también confirmaron los datos in vivo como se muestra en la Fig. 6c.

(a) Las imágenes ópticas con L-PEG2000-DBCO permitieron la detección de la etapa temprana del tumor de mama subcutáneo (MDA-MB-231 con un tamaño de tumor de 10 ~ 20 mm3, 3 días después de la implantación, invisible a simple vista y campo brillante como lo indica flechas); (b) imágenes ópticas ex vivo del tumor y los órganos principales con L-PEG2000-DBCO y (c) imágenes ópticas de xenoinjerto de tumor MDA-MB-231 con L-PEG2000 en comparación con L-PEG2000-DBCO.

A pesar del trabajo significativo en la tecnología de liposomas durante las últimas décadas, los enfoques para optimizar la formulación de la superficie de los liposomas han permanecido en gran medida sin explorar. Nuestros hallazgos demuestran un papel clave para los restos funcionales de superficie en la internalización celular y la captación de tumores. Las superficies liposomales se han utilizado ampliamente para conjugar fármacos (el llamado liposoma dirigido) para diversas aplicaciones terapéuticas, algunas utilizan el resto DBCO como el sitio para la conjugación del fármaco a través de la "química de clic" libre de cobre22,23,24. Sin embargo, la conjugación de la superficie puede reducir la eficiencia de la internalización celular liposomal y la absorción del tumor, lo que reduce la eficacia de la administración del fármaco. En este estudio, descubrimos que recubrir la superficie liposomal con el resto DBCO (L-PEG2000-DBCO) puede conducir a una captación tumoral notablemente alta. Realizamos una serie de experimentos in vitro, in vivo y ex vivo para demostrar que L-PEG2000-DBCO es superior al L-PEG2000 convencional. Inicialmente estudiamos la captación liposomal en células normales y de cáncer de mama in vitro mediante citometría de flujo y microscopía confocal. La citometría de flujo indicó una mayor captación de L-PEG2000-DBCO en comparación con L-PEG2000, un hallazgo que fue confirmado por microscopía confocal (Fig. 2). Dado que las imágenes ópticas se pueden usar de manera efectiva para monitorear el tráfico liposomal in vitro e in vivo a través del tinte fluorescente encapsulado en la bicapa lipídica liposomal, utilizamos imágenes ópticas para rastrear la biodistribución de L-PEG2000-DBCO in vivo en varios modelos de cáncer de mama. En un experimento de control, las soluciones de liposomas con volúmenes iguales de L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO exhibieron una intensidad de fluorescencia similar (Fig. 5a y Figura S2), lo que justifica el uso de la intensidad de fluorescencia como medida para cuantificar la biodistribución liposomal in vitro e in vivo y ex vivo. El examen de los tumores de mama (Figs. 3, 4, 5, 6) demostró que L-PEG2000-DBCO fue captado preferentemente in vivo por los tejidos tumorales y reducido en hígado y bazo en comparación con L-PEG2000. Por ejemplo, los datos in vivo obtenidos con el xenoinjerto tumoral MDA-MB-231 mostraron que la intensidad de la señal tumoral de L-PEG2000-DBCO y L-PEG2000 fue de 12,2 × 1010 y 3,9 × 1010 p/seg/sr/mW (Fig. 5c), respectivamente, correspondientes a un aumento del 213 % en la acumulación de tumores L-PEG2000-DBCO en comparación con L-PEG2000. Por el contrario, la intensidad de la señal hepática de L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO fue de 11,2 × 1010 y 6,3 × 1010 p/seg/sr/mW, respectivamente, lo que corresponde a una reducción del 46 % en la captación hepática de L-PEG2000-DBCO relativa. a L-PEG2000. Además, las secciones de tejido tumoral y hepático obtenidas por microscopía confocal confirmaron aún más la imagen óptica in vivo y ex vivo (Fig. 5d).

Esperamos que nuestros hallazgos encuentren aplicación en la entrega eficiente de compuestos de imágenes moleculares, sondas guiadas por imágenes y terapias contra el cáncer. Una ventaja es la capacidad de L-PEG2000-DBCO para visualizar tumores pequeños, como un pequeño implante ortotópico 4T1 (Fig. 2). L-PEG2000-DBCO pudo detectar un pequeño tumor de mama subcutáneo (MDA-MB-231, tamaño 10 ~ 20 mm3) que era invisible tanto a simple vista como en el campo brillante, como indican las flechas en la Fig. 6. En conjunto , los datos en las Figs. 3 y 6 demuestran que L-PEG2000-DBCO ha mostrado la capacidad de visualizar el tumor pequeño en modelos de trasplante tanto alogénico (4T1) como xenogénico (MDA-MB-231). Además, L-PEG2000-DBCO pudo detectar, visualizar y discriminar entre un tumor pequeño (10 ~ 15 mm3) y el tumor MDA-MB-231 principal adyacente (196 ~ 255 mm3) y acumularse en el tumor pequeño con el misma densidad de señal que la del tumor grande (Figura S3). Por lo tanto, actualmente buscamos la utilidad de L-PEG2000-DBCO para imágenes moleculares y cirugía guiada por imágenes.

El mecanismo que impulsa la alta captación tumoral de L-PEG2000-DBCO y cómo el resto DBCO facilita esto no se comprende completamente. Por ejemplo, la conjugación de L-PEG2000-DBCO con péptidos DV1-N3 conduce a una menor absorción tumoral, similar a L-PEG2000, lo que subraya el papel clave de la fracción DBCO en la conducción de una alta absorción tumoral12. Es probable que el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR) contribuya a la absorción tumoral mejorada. Los tiempos de circulación prolongados permiten que el liposoma penetre preferentemente en el tejido tumoral a través de la vasculatura tumoral permeable y permanezca en el lecho tumoral a través del drenaje linfático alterado25. Sin embargo, se informó que el efecto EPR por sí solo ofrece menos del doble de aumento en la administración de nanofármacos25,26. Se necesitarán más estudios de liposomas marcados con DBCO para ayudar a desentrañar el mecanismo de alta acumulación de L-PEG2000-DBCO en tejidos tumorales y baja acumulación en tejidos no objetivo que normalmente median la toxicidad terapéutica. Las modificaciones químicas mejoradas de los liposomas marcados con DBCO pueden conducir a formulaciones mejoradas con especificidad tumoral mejorada. Estos estudios están en curso en nuestro laboratorio y se informarán en futuras publicaciones.

En resumen, la superficie del liposoma puede influir significativamente en la captación celular in vitro y la penetración in vivo en los tejidos tumorales al tiempo que minimiza la penetración en los tejidos no diana. Somos optimistas de que nuestros hallazgos allanarán el camino para el diseño de liposomas de próxima generación para la entrega eficiente de imágenes moleculares y sondas guiadas por imágenes, así como terapias contra el cáncer.

Realizamos una serie de experimentos in vitro e in vivo para demostrar que la modificación de la superficie liposomal puede desempeñar un papel clave en la inducción de una alta internalización celular in vitro y una alta acumulación liposomal en tejidos cancerosos in vivo. Específicamente, descubrimos que una capa blanda de DBCO induce un aumento notable en la absorción tumoral de L-PEG2000-DBCO en comparación con L-PEG2000 a pesar de que ambas formulaciones liposomales comparten un esqueleto idéntico. Hemos demostrado la mayor capacidad de L-PEG2000-DBCO para acumularse en focos de cáncer de mama independientemente del tamaño del tumor, el tipo, la posición, la expresión del receptor, así como la condición de los ratones huéspedes. Sorprendentemente, también se observó una reducción significativa en la captación de L-PEG2000-DBCO en el hígado y tejidos fuera del objetivo en comparación con L-PEG2000. En conjunto, nuestros hallazgos allanarán el camino para el desarrollo de nuevas formulaciones liposomales con internalización mejorada por parte de los tejidos tumorales. Actualmente estamos explorando la utilidad de L-PEG2000-DBCO como un portador eficaz de sondas guiadas por imágenes y de imágenes moleculares.

1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[dibenzociclooctilo(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (DSPE-PEG2000-DBCO), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina -N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (DSPE-PEG2000) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). El perclorato de 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina (DiI) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). La amina Cy5 (no sulfonada) se adquirió de APExBIO Technology LLC (Houston, Texas). (Yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina) (DiR) se adquirió de Biotium™ (Fremont, CA). El suero bovino fetal certificado (FBS) se obtuvo de Gibco® por Life Technologies Corporation (Grand Island, NY). La membrana grabada con seguimiento Nuclepore (tamaño de poro: 100 nm, 200 nm) se obtuvo de Whatman (Florham Park, NJ).

Se prepararon liposomas modificados con PEG2000-DBCO (L-PEG2000-DBCO) y liposomas recubiertos con PEG2000 (L-PEG) por el método de extrusión15. Brevemente, una mezcla de DOPC: DSPE-PEG2000-DBCO: colorante DiR (97:2:1, mol:mol:mol) o DOPC: DSPE-PEG2000: colorante DiR (97:2:1, mol:mol:mol) se solubilizaron en cloroformo y se secaron en rotavapor a presión reducida. En particular, el tinte DiR se puede cambiar a DiI y Cy5-amina de acuerdo con el diseño experimental deseable. La película lipídica se hidrató en 5 ml de agua DI (pH 7,0) con agitación suave para producir una solución lipídica 2,6 mM. La solución de lípidos pasó por 10 ciclos de congelación y descongelación para formar liposomas multilamelares. Los liposomas se extruyeron a través de una Northern Lipids Extruder con membranas nanoporosas de policarbonato de 200 nm y 100 nm secuencialmente. Después de la extrusión, la solución de liposomas se dializó en tampón Tris-HCl (pH 7,4) utilizando un casete de diálisis Slide-A-Lyzer (MWCO 100 kDa) durante la noche a temperatura ambiente (RT).

Se utilizó dispersión de luz dinámica (DLS) para controlar la integridad, el tamaño y el potencial zeta de las vesículas durante y después de la reacción de acoplamiento.

Los liposomas (1 ml, lípidos 2,6 μM) se tiñeron con OsO4 al 1 % en PBS 0,1 M en un baño de hielo durante 1 min. La solución se filtró a través de una membrana grabada con huellas nuclepore de 100 nm. La película se deshidrató en una serie graduada de etanol (50 %–75 %–100 %–100 %) durante 15 min en cada paso. La película se secó mediante secado en punto crítico según las instrucciones del fabricante. La película se adhirió a la parte superior del disco de acero con cinta conductora, se pulverizó con oro y se usó para la detección SEM.

Todas las líneas celulares se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA). La célula epitelial renal no neoplásica de Cercopithecus aethiops: línea celular normal de riñón (Vero), línea celular de cáncer de mama primario humano Her2/neu+ (MCF-7), líneas celulares de cáncer de mama triple negativo humano (MDA-MB-NT17631 y MDA- MB-436) y la línea celular de cáncer epitelial mamario de ratón (4T1) se utilizaron en nuestros estudios actuales. Todas las líneas de células cancerosas se cultivaron en DMEM con 10 % de FBS y 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Todas las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %.

Para la unión de liposomas analizada por citometría de flujo, se sembraron Vero, MCF-7, MDA-MB-231 y MDA-MB-436 (2 × 106) en un matraz de 75 cm2 durante 2 a 5 días. Después de alcanzar una confluencia del 50 %, las células se separaron con tripsina al 0,25 %/EDTA al 0,1 % seguido de lavado con PBS dos veces. Después de bloquear con BSA (1 %) durante 30 min, las muestras se tiñeron con liposomas con colorante DiI durante 2 h a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 (0,15 mM de lípidos por 106 células). Después de lavar dos veces con PBS, las muestras se resuspendieron en 500 μl de PBS y se evaluaron mediante citometría de flujo utilizando un analizador BD LSR II (B&D Bioscience, CA).

La captación liposomal en las células se analizó mediante microscopía confocal. Se sembraron células MDA-MB-231 (2 × 105) en un sistema de portaobjetos de cámara Lab-Tek II por separado con 2 ml de medio durante la noche a 37 °C. Las muestras se tiñeron con liposomas con colorante DiI durante 2 h a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 (0,15 mM de lípidos por 106 células). Después de retirar el medio, las células se enjuagaron dos veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 4 % en PBS a TA durante 10 min. Se usó DAPI para teñir el núcleo celular seguido de lavado con PBS tres veces. Las células se examinaron bajo un microscopio fluorescente confocal LSM 710 (Zeiss). Las imágenes digitales fueron capturadas y procesadas con el software Image J (NIH).

Todos los experimentos con animales evaluados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC). Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del protocolo IACUC aprobado y de acuerdo con las pautas ARRIVE.

Se ordenaron 24 ratones hembra NOD.Cg-Prkdcscid/J (ratones SCID) y 12 ratones hembra Babl/C del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Para el modelo de trasplante alogénico, las células 4T1 se recogieron de 3 placas y se lavaron con PBS. Luego se inyectaron 20 k células por ratón de suspensiones celulares en la segunda palmadita de grasa mamaria (recuento desde abajo) con una pequeña incisión para establecer un único nódulo tumoral en el sitio de la inyección. Después de 3 días de crecimiento, las células 4T1 se implantaron en la almohadilla de grasa mamaria y formaron un tumor sólido de 15 ~ 25 mm3. Luego, los ratones se dividieron en dos grupos: el grupo L-PEG2000 y el grupo L-PEG2000-DBCO, que recibieron la formulación liposomal mediante inyección IV, respectivamente. La intensidad de la señal del tumor, el peso corporal y las condiciones de vida de los ratones se registraron con puntos de tiempo diseñados después de la administración de liposomas. El segundo ciclo de inyección se administró después de 96 h de la primera administración de liposomas.

Para los modelos de trasplante xenogénico, las células MCF-7, MDA-MB-231 y MDA-MB-436 se recogieron de 12 placas y se lavaron con PBS. A continuación, se inyectaron subcutáneamente 50 k células por ratón de suspensiones celulares en el hombro derecho para construir los modelos xenogénicos de cáncer de mama. El tamaño del tumor alcanzó alrededor de 100 mm3 después de 7 ~ 10 días para MDA-MB-231, 15 ~ 20 días para MDA-MB-36 y 25 ~ 30 días para MCF-7, respectivamente. Luego, a los diferentes grupos de modelos de cáncer de mama se les inyectó el mismo volumen de L-PEG2000) o L-PEG2000-DBCO.

Las imágenes in vivo y ex vivo se realizaron utilizando el sistema IVIS Lumina III (Perkin Elmer). Brevemente, para asegurarse de que la intensidad de la fluorescencia esté al mismo nivel, se colocaron 3 × 100 μl de las soluciones L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO en placas de 96 pocillos por separado antes de la administración y el escaneo bajo DiR cerca del infrarrojo archivado a través de los siguientes parámetros: filtro de excitación de 740 nm, filtro de emisión de 790 nm, binning 4 u 8, f/Stop 2. Estos ratones a los que se les administraron los diferentes liposomas se escanearon de forma no invasiva tres veces bajo anestesia (2 % de isoflurano a través del vaporizador del instrumento IVIS). Después del análisis in vivo, los ratones se sacrificaron inmediatamente. Se recogieron los órganos (tumor, hígado, corazón, pulmón, bazo, cerebro, riñón, intestino delgado y colon) y se adquirieron imágenes utilizando los mismos parámetros descritos anteriormente. Las imágenes recopiladas se analizaron con el software Living Image 4.3.1 (Perkin Elmer): se diseñaron ROI para seleccionar adecuadamente cada órgano y se calculó la eficiencia radiante.

A los ratones portadores de tumores se les inyectaron los liposomas L-PEG2000 y L-PEG2000-DBCO con componentes DiI al 2%, respectivamente. Después de 24 h de la administración de liposomas, los tumores y los hígados se cosechan y se congelan en un refrigerador a -80 °C. Las muestras congeladas se cortaron aún más en secciones (10 μm) con un criostato (CM3050 S, Leica, Alemania). Las secciones se tiñeron con DAPI, luego se sellaron con aceite de montaje y luego se observaron usando un microscopio de barrido láser confocal (Zeiss, LSM 710).

Todos los experimentos cuantitativos se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba posterior de Tukey. Las diferencias entre grupos a un nivel de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas (*representadas) y las de p < 0,01 como altamente significativas (**representadas).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado [y sus archivos de información complementarios].

Lamichhane, N. et al. Liposomas: aplicaciones clínicas y potencial para la administración de fármacos guiada por imágenes. Moléculas https://doi.org/10.3390/molecules23020288 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Li, M. et al. Diseño de composición y aplicación médica de liposomas. EUR. J.Med. química 164, 640–653. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2019.01.007 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Cattel, L., Ceruti, M. & Dosio, F. De los liposomas convencionales a los sigilosos: una nueva frontera en la quimioterapia contra el cáncer. Tumori 89(3), 237–249 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Soloman, R. & Gabizon, AA Farmacología clínica de las antraciclinas liposomales: Centrarse en la doxorrubicina liposomal pegilada. clin. Linfoma Mieloma. 8(1), 21–32. https://doi.org/10.3816/clm.2008.n.001 (2008).

Artículo PubMed Google Académico

Abraham, SA et al. La formulación liposomal de doxorrubicina. Métodos Enzymol. 391, 71–97. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(05)91004-5 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Malam, Y., Loizidou, M. & Seifalian, AM Liposomas y nanopartículas: vehículos nanométricos para la administración de fármacos en el cáncer. Tendencias Pharmacol. ciencia 30(11), 592–599. https://doi.org/10.1016/j.tips.2009.08.004 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ding, H. & Wu, F. Biodistribución de fármacos guiada por imágenes y administración de fármacos. teranóstica. 2(11), 1037–1039. https://doi.org/10.7150/thno.5321 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haemmerich, D. Administración de fármacos dirigidos guiada por imágenes no invasiva. Lanceta Oncol. 19(8), 1000–1001. https://doi.org/10.1016/s1470-2045(18)30419-4 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Haemmerich, D. & Motamarry, A. Liposomas termosensibles para la administración de fármacos guiada por imágenes. Adv. Cáncer Res. 139, 121–146. https://doi.org/10.1016/bs.acr.2018.04.004 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lamichhane, N., Dewkar, GK, Sundaresan, G., Mahon, RN y Zweit, J. [(18)F]-Carboplatino fluorado y [(111)In]-liposoma para la administración de fármacos guiada por imágenes. En t. J. Mol. ciencia 18, 5. https://doi.org/10.3390/ijms18051079 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Phillips, WT, Bao, A., Brenner, AJ & Goins, BA Terapia intervencionista guiada por imágenes para el cáncer con nanopartículas radioterapéuticas. Adv. Entrega de drogas Rev. 76, 39–59. https://doi.org/10.1016/j.addr.2014.07.001 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, D. et al. La densidad de péptidos se dirige e impide la metástasis del cáncer de mama triple negativo. Nat. común 9(1), 2612. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05035-5 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kenchegowda, M. et al. Nanoportadores inteligentes como una plataforma emergente para la terapia del cáncer: una revisión. Moléculas 27, 1. https://doi.org/10.3390/molecules27010146 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Guo, P. et al. La elasticidad de las nanopartículas dirige la captación del tumor. Nat. común 9(1), 130. https://doi.org/10.1038/s41467-017-02588-9 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gunawan, R. & Auguste, D. Los inmunoliposomas que se dirigen al endotelio in vitro dependen de la formación de balsas lipídicas. mol. Farmacia 2010, 1569–1575. https://doi.org/10.1021/mp9003095 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Arroyo-Crespo, JJ et al. La caracterización de modelos preclínicos de cáncer de mama triple negativo proporciona evidencia funcional de progresión metastásica. En t. J. Cáncer. 145(8), 2267–2281. https://doi.org/10.1002/ijc.32270 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rashid, OM et al. Un modelo murino ortotópico singénico mejorado de la progresión del cáncer de mama humano. Res. de cáncer de mama. Tratar. 147(3), 501–512. https://doi.org/10.1007/s10549-014-3118-0 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Paschall, AV & Liu, K. Un modelo de ratón ortotópico de metástasis espontánea de cáncer de mama. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/54040 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Abu Lila, AS, Kiwada, H. & Ishida, T. El fenómeno del aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC): desafío clínico y enfoques para manejar. J. Liberación de control. 172(1), 38–47. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2013.07.026 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shimizu, T. et al. Una versión de hidroxilo PEG de liposomas PEGilados y su impacto en la inducción de IgM anti-PEG y en la eliminación acelerada de liposomas PEGilados. EUR. J. Pharm. Biofarmacia 127, 142–149. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.02.019 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ishida, T. & Kiwada, H. Fenómeno de aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC) tras la inyección repetida de liposomas PEGilados. En t. J. Pharm. 354(1–2), 56–62. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.11.005 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Desai, TJ et al. Ensayo de permeabilidad de la membrana con clic de liposomas para identificar péptidos permeables. Farmacia Res. 38(5), 843–850. https://doi.org/10.1007/s11095-021-03005-z (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Qin, H. et al. Desarrollo de una vacuna contra el cáncer utilizando la acumulación de ganglios linfáticos activos mediada por química de clics in vivo para mejorar la inmunoterapia. Adv. Mate. 33(20), e2006007. https://doi.org/10.1002/adma.202006007 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, L. et al. Síntesis recombinante y quimio-/bio-ortogonal de trombomodulina liposomal y su actividad antitrombótica. J. Biosci. Bioing. 124(4), 445–451. https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2017.05.008 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsumura, Y. & Maeda, H. Un nuevo concepto para la terapéutica macromolecular en la quimioterapia del cáncer: mecanismo de acumulación tumoritrópica de proteínas y el agente antitumoral smancs. Cáncer Res. 46 (12 Parte 1), 6387–6392 (1986).

CAS PubMed Google Académico

Nakamura, Y., Mochida, A., Choyke, PL & Kobayashi, H. Entrega de nanofármacos: ¿Es suficiente la permeabilidad mejorada y el efecto de retención para curar el cáncer?. bioconjugador química 27(10), 2225–2238. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.6b00437 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Los autores desean agradecer al Stony Brook Cancer Center por el apoyo inicial brindado al Turkman Lab. Además, la investigación reportada en esta publicación fue financiada en parte por el fondo caritativo de noviembre de Lynn (Turkman).

Stony Brook Cancer Center, Stony Brook, Long Island, EE. UU.

Daxing Liu, Jules Cohen y Nashaat Turkman

Departamento de Radiología y Centro del Cáncer, Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, 100 Nicolls Road, Stony Brook, NY, 11794, EE. UU.

Daxing Liu y Nashaat Turkman

División de Hematología/Oncología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de Stony Brook, Long Island, NY, EE. UU.

Julio Cohen

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Todos los autores revisaron el manuscrito y contribuyeron al diseño del estudio, el análisis de datos y la redacción del manuscrito. DL realizó los experimentos.

Correspondencia a Nashaat Turkman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Liu, D., Cohen, J. & Turkman, N. El revestimiento de superficie PEG2000-DBCO aumenta la captación intracelular de liposomas por xenoinjertos de cáncer de mama. Informe científico 12, 10564 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

Descargar cita

Recibido: 03 Abril 2022

Aceptado: 15 junio 2022

Publicado: 22 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.