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Jun 05, 2023

Salida de Ca2+ facilitada por co

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 573 (2023) Citar este artículo

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Ca2+ es un importante mensajero de señalización. En microorganismos, hongos y plantas, se sabe que los antiportadores de H+/Ca2+ (CAX) desempeñan un papel clave en la homeostasis del Ca2+ intracelular al catalizar su salida a través de la membrana celular. Aquí, revelamos que el homólogo CAX bacteriano YfkE transporta Ca2+ en dos modos distintos: un modo de intercambio H+/Ca2+ de flujo bajo y un modo de flujo alto en el que los iones Ca2+ y fosfato se cotransportan (1:1) a cambio de H+. El acoplamiento con fosfato acelera en gran medida la actividad de salida de Ca2+ de YfkE. Nuestros estudios revelan que el Ca2+ y el fosfato se unen a sitios adyacentes en una vía de translocación central y conducen a conocimientos mecánicos que explican cómo este CAX altera sus motivos de repetición alfa conservados para adoptar el fosfato como un "acompañante de transporte" específico para la translocación de Ca2+. Este hallazgo descubre un mecanismo de cotransporte dentro de la familia CAX que indica que esta clase de proteínas contribuye a la homeostasis celular tanto del Ca2+ como del fosfato.

Los iones de calcio se encuentran entre los iones metálicos más abundantes en la naturaleza y son cruciales para muchas funciones importantes en las células, donde el Ca2+ sirve como mensajero versátil1,2. Las señales de Ca2+ normalmente se inician por la entrada de Ca2+ en el citoplasma a través de canales de membrana selectivos y se aumentan aún más por la salida de Ca2+ de los orgánulos intracelulares como el retículo endoplásmico. Sin embargo, los altos niveles sostenidos de Ca2+ citosólico son letales. Los antiportadores de cationes de calcio (CaCA) son clave para restaurar la homeostasis del Ca2+. Esta familia de transportadores de membrana, que incluye antiportadores de H+/Ca2+ (CAX) e intercambiadores de Na+/Ca2+ (NCX), secuestra y exporta activamente Ca2+ fuera del citosol, impulsado por la entrada de H+ o Na+ a través de gradientes electroquímicos transmembrana3,4.

Los CAX son ubicuos en bacterias, hongos y plantas3. Por ejemplo, se han identificado tres homólogos de CAX, conocidos como CAX1-3, en Arabidopsis, y más de otros veinte en manzanos3,5. En las células vegetales, las proteínas CAX están presentes tanto en el plasma como en las membranas de los tonoplastos y facilitan el movimiento del Ca2+ citosólico fuera de la célula o de regreso a las vacuolas ácidas, en respuesta a diversos estímulos, incluidos el frío, la salinidad y los cambios de pH del suelo5,6, 7,8. Los homólogos de CAX también son omnipresentes en los microorganismos, aunque sus funciones fisiológicas requieren más investigación. El Ca2+ está involucrado en una amplia gama de procesos bacterianos que incluyen la quimiotaxis, la división celular y la esporulación;9 la señalización del Ca2+ también se ha implicado en la infección bacteriana y en las interacciones huésped-patógeno10. Es probable que las proteínas CAX desempeñen un papel central en estos procesos, ya que parecen ser los principales sistemas de salida de Ca2+ en las bacterias. Por lo tanto, dilucidar el mecanismo de transporte de CAX ayudará a comprender cómo estos organismos mantienen el equilibrio de Ca2+ en respuesta a las perturbaciones y señalización de Ca2+.

Estructuralmente, todas las proteínas CAX parecen compartir una arquitectura básica común, que consta de once hélices transmembrana (TM). Dos motivos de secuencia conservados, denominados repeticiones α, se encuentran en las hélices TM2-3 y TM7-8 y parecen proporcionar sitios para el reconocimiento de H+ y Ca2+. Las estructuras de rayos X han comenzado recientemente a revelar la base molecular del mecanismo de esta clase de antiportadores, a saber, los de YfkE de Bacillus subtilis, VCX1 de Saccharomyces cerevisiae y CAX_Af de Archaeoglobus fulgidus11,12,13. Estas estructuras sugieren un mecanismo en el que las hélices TM2-3 y TM7-8 adoptan distintos arreglos que alternativamente exponen sitios de reconocimiento para H+ y Ca2+ a ambos lados de la membrana. Sin embargo, estas tres estructuras capturan un estado similar en el mecanismo de acceso alterno, a saber, uno que está abierto hacia adentro (es decir, al citosol), en el que dos residuos de glutamato conservados importantes para la actividad de intercambio H+/Ca2+ están ubicados adyacentemente en un ion central. -sitio de unión. Estos dos residuos de carboxilato coordinan un ion Ca2+ en la estructura VCX111. Si las estructuras de YfkE y CAX_Af capturan un estado sin ligando o uno unido a H+ no fue evidente de inmediato, aunque los dos residuos de carboxilato (E72 y E255 en YfkE) adoptan conformaciones diferentes en comparación con el estado unido a Ca2+ de VCX1. Recientemente, nuestros estudios para YfkE también han descubierto que su mecanismo de acceso alterno está regulado alostéricamente por la unión de Ca2+ a un minisensor12 de Ca2+ intracelular.

Aquí revelamos un tipo de mecanismo de transporte de Ca2+ para YfkE y posiblemente otros miembros de la familia CAX. Demostramos que YfkE presenta un modo de transporte en el que el Ca2+ y el fosfato inorgánico (Pi) se cotranslocan en una proporción de 1:1, a cambio de H+. El acoplamiento a Pi transforma YfkE de un antiportador de bajo flujo a uno de alto flujo. Para obtener información sobre este mecanismo de cotransporte de Ca2+-Pi, utilizamos múltiples enfoques bioquímicos y biofísicos junto con simulaciones por computadora y modelos moleculares basados ​​en experimentos. Nuestros resultados nos llevan a concluir que Ca2+ y Pi se unen a un sitio de reconocimiento compartido dentro del interior del transportador, que incluye E72 y E255, así como otros residuos polares en la vecindad. Sin embargo, E72 y E255 pueden unirse a H+, lo que explica la capacidad de YfkE para aprovechar el gradiente de H+ para impulsar el transporte de Ca2+ y Pi. Nuestros resultados también nos permiten racionalizar por qué la translocación de aniones Pi acelera la reacción de intercambio Ca2+/H+.

Pi es un nutriente importante y es abundante en las células para la síntesis de nucleótidos, energía y fosfolípidos. Proporcionamos un ejemplo de que una proteína transportadora al mismo tiempo facilita la translocación de membrana de Ca2+ y Pi. Nuestros hallazgos no solo revelan un modo de transporte único dentro de la familia CAX, sino que también sugieren su papel fisiológico en la homeostasis tanto del Ca2+ como del fosfato en las células.

Para comenzar a caracterizar YfkE, medimos su actividad de transporte de Ca2+ usando vesículas de adentro hacia afuera, luego de que se estableciera un gradiente de H+ hacia afuera al agregar NADH, que activa el bombeo de H+ hacia las vesículas por medio de la cadena de transporte de electrones. Como era de esperar, el transcurso del tiempo resultante mostró que Ca2+ fue transportado a las vesículas YfkE (Fig. 1a). La actividad de transporte observada se ajustó bien al modelo cinético de Michaelis-Menten, produciendo KM = 69 µM y Vmax = 4,2 µmol/min/g (Fig. 1b). Sorprendentemente, la adición de fosfato inorgánico (Pi) 5 mM a la solución externa (es decir, el lado intracelular de la vesícula) aceleró fuertemente la actividad de transporte de Ca2+ de YfkE ocho veces (Fig. 1a). Específicamente, el análisis cinético reveló KM = 198,7 µM y Vmax = 33,3 µmol/min/g (Fig. 1b). Por el contrario, no observamos ningún efecto para los análogos de Pi como nitrato, sulfato, arseniato y vanadato (Fig. 1 complementaria), o para ATP (Fig. 2 complementaria), lo que indica que la aceleración del transporte de Ca2+ por YfkE está mediada específicamente por Pi . Vale la pena señalar que Ca(H2PO4)2, la principal forma de compuestos de fosfato de calcio a pH neutro, es altamente soluble en soluciones acuosas. Consistentemente, no observamos acumulación de Ca2+ en vesículas de control desprovistas de YfkE incluso cuando Pi estaba presente (Fig. 1a), descartando que Ca2+ y Pi puedan formar un precipitado. Estos resultados indican que YfkE aprovecha la disponibilidad de Pi citosólico para regular al alza su actividad antipuerto H+/Ca2+.

a Ensayos de transporte de 45Ca2+ (+/− Pi) medidos usando vesículas de adentro hacia afuera. Las vesículas se mezclaron con Pi 5 mM antes de añadir 45CaCl2 0,5 mM para desencadenar las reacciones a temperatura ambiente. Se usaron vesículas vacías como control. b Análisis cinético del transporte de Ca2+ de YfkE (+/−5 mM Pi). Los datos se restaron con las respectivas vesículas de control y luego se ajustaron a la cinética de Michalis-Menten utilizando GraphPad 9. Las barras de error representan las desviaciones estándar (n = 3).

Estas observaciones nos llevaron a plantear la hipótesis de que Pi estimula la actividad de YfkE porque Ca2+ y Pi son cotransportados. Aunque, hasta donde sabemos, no se ha observado el transporte de Pi para otros antiportadores de CAX, se ha informado el cotransporte de un catión y Pi para otras familias de proteínas. Por ejemplo, el simportador de Na+/Pi SLC34 utiliza un gradiente de Na+ para impulsar la captación de Pi14. Para probar esta hipótesis, medimos el transporte de Pi usando 32P-fosfato de potasio como sustrato. Como se ve en la Fig. 2a, Pi se importó a las vesículas YfkE de manera dependiente del tiempo. De acuerdo con los ensayos de transporte de Ca2+ (Fig. 1a), la captación de Pi solo se observó en presencia de Ca2+ (+0,5 mM) y no se detectó afluencia cuando Ca2+ estaba ausente (Fig. 2a). De manera similar, no se detectó captación de Pi en las vesículas de control que carecían de YfkE, ya sea en presencia o ausencia de Ca2+ (Fig. 2a). Estos resultados plantearon la hipótesis de que YfkE cataliza el cotransporte de Ca2+ y Pi.

a Evolución temporal del transporte de Pi de YfkE medido usando vesículas de adentro hacia afuera (+/- 0,5 mM Ca2+). Se añadió sustrato 32Pi 5 mM a la reacción. Se usaron vesículas vacías como control. b Imagen SDS-PAGE teñida con Coomassie de la proteína YfkE purificada. c Evaluación de la orientación de YfkE en proteoliposomas tratados con trombina. La inmunotransferencia se desarrolló utilizando anticuerpos anti-His. Los ensayos de transporte de 32Pi se midieron utilizando proteoliposomas reconstituidos, lo que muestra que YfkE importa Pi en presencia de Ca2+ 0,5 mM, no en presencia de EDTA 2 mM. Las barras de error representan desviaciones estándar (n = 3).

Los ensayos de vesículas descritos anteriormente demuestran que se requiere YfkE para el cotransporte de Ca2+ y Pi, ya que esta actividad tampoco se observó en las vesículas de control que carecen de YfkE (Figs. 1a y 2a). Para determinar que YfkE solo media esta actividad sin que participen otras proteínas de transporte de iones, purificamos YfkE y lo reconstituimos en proteoliposomas (Fig. 2b, c y Fig. 3 complementaria). Es probable que la orientación de YfkE en estos proteoliposomas sea del lado derecho, evaluada mediante proteólisis limitada, ya que la trombina eliminaría la etiqueta His N-terminal de YfkE en la superficie intracelular (Fig. 2c y Fig. 3 complementaria). Para iniciar la reacción de transporte, se estableció un gradiente de pH externo diluyendo los proteoliposomas (pH 7,4) en un tampón de pH más alto (pH 8) y se midió la captación de Pi acoplado a H+ usando fosfato P32. Los resultados mostraron claramente que YfkE importa Pi a los proteoliposomas en presencia de Ca2+ 0,5 mM, pero no en ausencia de Ca2+ (+EDTA 2 mM) (Fig. 2d). Estos resultados validan nuestros ensayos de vesículas y confirman además que YfkE solo cotransporta Ca2+/Pi a través de la membrana a cambio de H+.

De acuerdo con el mecanismo de cotransporte, la actividad de transporte de Pi de YfkE WT disminuyó significativamente cuando la concentración de Ca2+ se redujo de 0,5 mM (Fig. 2a) a 0,1 mM Ca2+ (Fig. 3a). La comparación de las tasas de transporte observadas para cada especie en las mismas vesículas indica que la estequiometría de este acoplamiento es 1 Ca2+:1 Pi (Fig. 3b, c). Sin embargo, en comparación con Ca2+, la afinidad de unión aparente de Pi es mucho más débil (KM = 4,9 mM), según el análisis de la cinética de transporte (Fig. 3d y Tabla 1). La unión del sustrato Pi también se demostró utilizando un ensayo de unión de 32Pi radiomarcado. Los resultados mostraron que Pi se unía a la proteína YfkE WT, pero se interrumpió por la mutación de E72A y E255A (Fig. 3e). La unión de Pi se caracterizó además mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC), lo que produjo una afinidad de unión de ~ 1 mM (Fig. 3f) en línea con el valor de KM generado a partir del análisis cinético de transporte (Fig. 3d). Junto con los ensayos de transporte anteriores, todas estas caracterizaciones in vitro confirman colectivamente que Pi es de hecho un sustrato de cotransporte de YfkE.

Se midieron ensayos de transporte de 32Pi usando vesículas de adentro hacia afuera, que no mostraron actividad de E72A (cuadrados rojos) y E255A en contraste con WT. Los ensayos se realizaron en presencia de Ca2+ 0,1 mM. b Velocidades de transporte de Ca2+ o Pi medidas en las mismas vesículas YfkE en los puntos de tiempo indicados. c Estequiometría de Ca2+ vs Pi comparando sus tasas de transporte (b). d Cinética de transporte de Pi de YfkE (+0,1 mM Ca2+) en las condiciones de pH citosólicas indicadas. Los datos se restaron con el control (-) y luego se ajustaron a la cinética de Michalis-Menten para calcular KM y Vmax usando GraphPad 9. e Ensayo de unión de 32Pi radiomarcado usando la proteína YfkE purificada de tipo salvaje, E72A y E255A inmovilizada en perlas de Ni-NTA . f Análisis ITC de la unión de Pi a YfkE. Se tituló Pi 10 mM en una solución de proteína YfkE. El ajuste del modelo cinético utilizando el software Origin produce una afinidad de unión de 0,93 ± 0,36 mM. g Pi parámetros cinéticos de transporte (KM y Vmax) de YfkE medidos al pH indicado. Las barras de error representan desviaciones estándar (n = 3 para (a, d, e, g); n = 4 para (b, c)).

En conjunto, estos datos nos llevan a concluir que YfkE cataliza la salida de Ca2+ utilizando dos modos o mecanismos diferentes: un modo lento, cuando Pi está ausente o en gran parte no disponible; y un modo rápido, cuando el Pi intracelular es suficientemente abundante, lo que implica el cotransporte de Ca2+ y Pi. Es importante destacar que, en ambos casos, el transporte de Ca2+ requiere un contratransporte de H+, a favor de su gradiente electroquímico, de acuerdo con el modelo de acceso alterno. En consecuencia, la adición del ionóforo H+ cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP) a nuestros ensayos de transporte anuló por completo la absorción de Ca2+ en las vesículas de adentro hacia afuera, en ausencia o presencia de Pi (Fig. 2 complementaria).

En solución, Pi puede existir en diferentes estados de ionización dependiendo del pH. En particular, el equilibrio entre el H2PO41− monoaniónico y el HPO42− dianiónico tiene un pKa de 7,2. Para evaluar qué especie de Pi es más probable que sea cotransportada con Ca2+ por YfkE, medimos la captación de Pi en vesículas de adentro hacia afuera variando el pH externo, es decir, variando la magnitud del gradiente de H+ hacia afuera, pero también el Pi equilibrios de ionización. Como se esperaba, la absorción de Pi se aceleró a medida que el pH externo aumentó de 6,5 a 7,5, lo que probablemente refleja una fuerza impulsora más fuerte del flujo de salida de H+ cuesta abajo (Fig. 3g). Sin embargo, a mayores valores de pH, el transporte se inhibió claramente, de manera gradual, lo que indica que YfkE no puede reconocer el Pi dianiónico sino el H2PO41 monoaniónico.

A diferencia de Ca2+, no existe una definición clara de un motivo de unión prototípico de Pi en las estructuras proteicas. Sin embargo, se sabe que la unión de Pi es favorecida por residuos cargados positivamente (arginina y lisina) y residuos polares como treonina, serina e histidina15. El sitio de reconocimiento de Ca2+ en el interior de YfkE, formado por E72, E255 y los residuos polares circundantes, es la única región adecuada para el reconocimiento de Pi en el dominio transmembrana de la proteína (Fig. 4a complementaria)12. Los intentos de identificar una vía alternativa para la translocación de Pi, por ejemplo, mediada por R4 y R46, dos residuos cargados positivamente en la superficie de la proteína intracelular, no produjeron alteración de la actividad de transporte de Pi (Figuras complementarias 4b, c y Tabla 1). Como se mencionó anteriormente, los ensayos de unión de Pi radiomarcados muestran que la mutación de los dos residuos que se sabe que coordinan Ca2+ también interrumpieron la unión de Pi (Fig. 3e), lo que indica que estos dos iones se unen cerca uno del otro, en un sitio de reconocimiento compartido dentro de la proteína.

Para probar aún más esta hipótesis, desarrollamos un ensayo basado en la transferencia de energía de resonancia de luminiscencia (LRET). Las mediciones de LRET informan sobre los cambios en la distancia entre un donante fluorescente y su aceptor, que se manifiestan como señales de luminiscencia de diferentes tiempos de vida. A través de este enfoque, buscamos determinar si el reconocimiento de Ca2+ y Pi induce cambios conformacionales comparables en YfkE. Al igual que los ensayos funcionales descritos anteriormente, estas mediciones se llevaron a cabo en vesículas de adentro hacia afuera, para examinar la proteína en su entorno de membrana nativo (ver 'Métodos' para más detalles). Específicamente, etiquetamos las posiciones G56 (bucle TM1-2 intracelular) y C3 (terminal amino) con quelato de terbio y Atto-465, respectivamente, usando química reactiva con tiol (Fig. 4a). Según los resultados de LRET, la distancia entre el donante y el aceptor en ausencia de cualquier sustrato es de 25,5 ± 0,2 Å (Fig. 4b). La adición de Ca2+ 0,5 mM o Pi 5 mM a las vesículas aumentó la distancia de manera similar, a 26,9 ± 0,3 Å. Para verificar este resultado, introdujimos el donante de quelato de terbio en la posición de S202 (en TM6), manteniendo el aceptor Atto-465 en C3 (Fig. 4d). Como se observó para G56, agregar Ca2+ o Pi aumentó la distancia entre el donante y el aceptor de manera similar, de 26,3 ± 0,1 Å a 27,7 ± 0,2 o 28 ± 0,2 Å (Fig. 4e). Es importante destacar que tanto los mutantes G56C como S202C retuvieron la actividad de absorción de Ca2+ en presencia de Pi (Fig. 5 complementaria). Por lo tanto, los cambios de distancia detectados por LRET probablemente reflejen cambios conformacionales de proteínas inducidos por la unión al sustrato. Es cierto que estos cambios son modestos, debido a una posición subóptima del donante y el aceptor y, por lo tanto, no es posible discernir qué movimientos de proteína están representados por estos datos. Sin embargo, estas diferencias son estadísticamente significativas y específicamente inducidas por Ca2+ o Pi. De hecho, no se observaron cambios tras la adición de sulfato 5 mM, un análogo de Pi (Fig. 4c, f). En conclusión, las mediciones de LRET respaldan nuestra hipótesis de que tanto Ca2+ como Pi acceden a un sitio de reconocimiento común dentro de la proteína.

a, d Tema del diseño experimental LRET para medir la distancia (línea discontinua roja) entre el donante (esfera azul) en el N-terminal C3 y el receptor (esfera roja) en G56C de TM1 (naranja) (a) o S202C de TM6 ( magenta) (d). Las hélices que forman caminos están coloreadas en verde; La escisión de trombina (que se muestra como una tijera) elimina el donante para calcular el fondo de la membrana sin procesar. Las flechas azules indican cambios conformacionales de hélice en la membrana. b, c, e, f Trazas LRET después de restar el fondo respectivo: forma apo (negro), +0,5 mM Ca2+ (azul), +5 mM Pi (rojo) y 5 mM sulfato (verde). b,c G56C; e, f S202C.

Para brindar un contexto estructural a estas mediciones bioquímicas y biofísicas, recurrimos al modelado molecular. Específicamente, buscamos construir un modelo hipotético que pudiera explicar cómo YfkE reconoce tanto Ca2+ como Pi de una manera que resulte en competencia con H+, como es la norma para un antiportador de iones acoplados. El primer paso en este proceso fue determinar si la estructura existente de YfkE12 que mira hacia adentro captura un estado unido a H+. Si es así, razonamos que esta estructura experimental proporcionaría una buena base para modelar el estado ligado a Ca2+ y Pi; de hecho, los datos estructurales disponibles para los antiportadores de membrana muestran que las formas alternativas unidas al sustrato del mismo estado funcional difieren principalmente en la configuración de las cadenas laterales que forman los sitios de unión al sustrato, sin cambios importantes en el esqueleto de la proteína.

Con ese fin, llevamos a cabo una serie de simulaciones de dinámica molecular de todos los átomos diseñadas para cuantificar la probabilidad de protonación de cadenas laterales seleccionadas dentro del interior del transportador (Fig. 6 complementaria). Específicamente, nos enfocamos en E72, E255 y H256, los tres residuos protonables en la vía central dentro de las repeticiones α (Fig. 5a). Se había predicho previamente que H256 estaría involucrado en la unión de H+, ya que se conserva en los CAX acoplados a H+, pero no en los NCX12 acoplados a Na+. Como controles negativos, también probamos E233 y H226, que están expuestos en la superficie de la proteína y, por lo tanto, no se espera que se desvíen significativamente de sus propensiones inherentes a la protonación en solución, para un pH determinado. Como se resume en la Tabla 2, nuestros resultados indican claramente que tanto E72 como E255 se protonan al mismo tiempo en la estructura interna existente de YfkE. Cuando los estados protonados y desprotonados se comparan individualmente, es más claro que el primero está fuertemente favorecido en la geometría específica capturada en la estructura cristalina, en relación con lo que es intrínseco para este tipo de cadena lateral en solución. (En otras palabras, el 'pKa aparente' tanto de E72 como de E255 en esta conformación específica está fuertemente desplazado hacia arriba). Esta propensión es considerablemente mayor para E72 que para E255, lo que sugiere que E72 es el último sitio en desprotonarse en el estado orientado hacia adentro. . Si se vuelve a evaluar E255 mientras E72 está protonado (es decir, sin carga), la probabilidad de protonación de E255 disminuye lógicamente, pero permanece fuertemente desplazada hacia arriba. Por el contrario, la propensión a la protonación calculada para el residuo superficial E233 es muy similar a la del glutamato libre en solución, ya sea que se suponga que E72 y E255 están protonados o no. Este resultado es el esperado para un sitio no funcional, lo que corrobora la validez de la metodología de simulación utilizada aquí para evaluar la energía de protonación relativa.

a Comparación entre las estructuras de YfkE protonado (cian) y VCX1 unido a Ca2+ (naranja), que muestra sus cambios conformacionales (flechas negras) de tres residuos titulables (palos) en la ruta de translocación. Los TM 2 y 7 se representan como dibujos animados. En VCX1, E106 interactúa con Ca2+ (esfera verde) a través de aguas (esfera roja) mediante enlaces H (líneas discontinuas negras). Los residuos de VCX1 están etiquetados subrayados. b Análisis cinético de transporte de 45Ca2+ medido usando vesículas de adentro hacia afuera que no muestra actividad de E72Q y E255Q en contraste con WT. Los datos se restaron con (-) vesículas de control. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3). c–e Curvas de titulación isotérmica de Ca2+ en una solución de proteína de YfkE WT (c), E255Q (d) y E72Q (e). El ajuste de datos se realizó mediante el software Origin.

En contraste con nuestros hallazgos para E72 y E255, el examen de H256 usando el mismo enfoque indica que esta cadena lateral está desprotonada en la conformación de YfkE capturada por la estructura cristalina (Tabla 2). Incluso cuando se supone que E72 y E255 tienen carga negativa, lo que en principio favorecería una carga positiva en H256, no detectamos un cambio significativo en la probabilidad de protonación de H256 en relación con un análogo de histidina en solución, o en relación con H226, que está expuesto. en la superficie de la proteína. Cuando se supone que E72 y E255 están protonados, la protonación de H256 es incluso menos probable; de hecho, se favorece claramente el H256 desprotonado (es decir, su 'pKa aparente' está desplazado hacia abajo).

En conclusión, este análisis indica que la estructura cristalina orientada hacia el interior de YfkE captura un estado unido al sustrato, es decir, con dos H+ unidos en los sitios E72 y E255. Sin embargo, H256 no se une simultáneamente a un tercer H+, lo que sugiere que la estequiometría antipuerto de YfkE podría ser 1Ca2+:2H+. Estos resultados son consistentes con la observación mencionada anteriormente de que la mutación de alanina de E72 o E255 anula el transporte de Ca2+ impulsado por H+ en ensayos experimentales12. Por el contrario, el efecto de la mutación de alanina de H256, aunque significativo, es comparable al de la mutación de otras cadenas laterales polares no protonables en la vecindad de los sitios de unión de H+, como N69A o Q281A12.

Como se mencionó, los estudios estructurales de una proteína CAX de levadura, VCX1, supuestamente detectaron un ion Ca2+ unido11. El sitio de unión está formado por dos residuos ácidos, E109 y E305, que son equivalentes a E72 y E255 en YfkE, respectivamente. Parece claro, por lo tanto, que 2 H+ compiten con 1 Ca2+ para unirse a este sitio. Sin embargo, las diferentes propensiones a la protonación de E72 y E255 sugieren que no son iguales en este mecanismo de competencia. De hecho, la estructura de VCX1 también indica las diferentes funciones de estos dos residuos de carboxilato en la unión de Ca2+, es decir, E305 (E255 en YfkE) coordina directamente Ca2+, mientras que E109 (E72 en YfkE) interactúa indirectamente con el ion a través de tres moléculas de agua ( Figura 5a)11. Para obtener información sobre sus roles específicos en la unión de Ca2+/H+, mutamos E72 y E255 a glutamina, por lo que se elimina la desprotonación mientras que la unión de Ca2+ sigue siendo posible en principio. Como era de esperar, la mutación E72Q o E255Q abolió por completo el transporte de Ca2+, ya que se requiere la desprotonación de ambas cadenas laterales de carboxilato para cerrar el ciclo antipuerto (Fig. 5b). Sin embargo, el examen de estas dos proteínas mutantes usando ITC confirmó que tienen funciones distintas en términos de unión de H+/Ca2+. La titulación de Ca2+ a WT YfkE produjo una afinidad de unión de 0,46 ± 0,02 µM (Fig. 5c). No se observó saturación para E255Q dentro del rango de titulación, lo que indica que se requiere el grupo carboxilato de E255 para la unión de Ca2+ (Fig. 5d). En marcado contraste, el carboxilato en E72 parece ser prescindible ya que E72Q no afecta la unión de Ca2+. En cambio, la mutación aumenta tres veces la afinidad aparente de unión a Ca2+ (Kd = 0,14 ± 0,001 µM) en comparación con WT (Fig. 5e). En conjunto, los resultados computacionales y experimentales sugieren que el primer paso en el mecanismo por el cual YfkE reconoce Ca2+ en el estado orientado hacia adentro es la desprotonación de E255; este paso es necesario y suficiente para la unión de Ca2+. La desprotonación de E72 ocurriría posteriormente y probablemente sería seguida por una transición conformacional a mayor escala hacia el estado orientado hacia afuera.

Múltiples líneas de evidencia respaldan que tanto Ca2+ como Pi se unen de manera adyacente en la vía de translocación central: primero, la mutación de los residuos involucrados en la unión de Ca2+, es decir, E72 y E255, no solo anulan el transporte de Pi (Fig. 3a) sino también la unión de Pi ( figura 3e); segundo, Ca2+ y Pi inducen cambios conformacionales similares medidos por LRET (Fig. 4); y tercero, el cotransporte de Pi altera la KM de Ca2+ (Fig. 1b). En la estructura de YfkE, varios residuos polares, incluidos N69, N99, Q252, Q281 y H256, se encuentran adyacentes a E72 y E255 en las proximidades del sitio de unión al transporte12. Aunque estos residuos polares se conservan en la familia CAX (Fig. 7 complementaria), no tienen una interacción directa con Ca2+ en la estructura de estado unido a Ca2+ de VCX111. Suponemos que estos residuos están involucrados en cambio en la unión de Pi. Para probar esta hipótesis, examinamos los efectos de la mutación de alanina de esos residuos polares utilizando ensayos de transporte Pi (Fig. 6a). El papel de cada residuo en la unión de Pi se evaluó mediante análisis KM de transporte (Tabla 1). Los cambios más significativos en KM se encontraron para Q281A y H256A, mostrando una reducción de seis o siete veces en comparación con WT, lo que indica un papel importante en el reconocimiento de Pi. Cabe señalar que estas mutaciones también interrumpen la captación de Ca2+12, de acuerdo con nuestra hipótesis de que los sitios de unión para Ca2+ y Pi son proximales.

a Ensayos cinéticos de transporte de Pi medidos usando vesículas de adentro hacia afuera: N69A, N99A, N252A, Q281A y H256A. Se usaron diferentes concentraciones (5 veces mayor que WT) de vesículas para mutantes para obtener datos útiles para el análisis cinético. Los datos se restaron con vesículas de control (-) y luego se ajustaron a la cinética de Michalis-Menten usando GraphPad 9. Las barras de error representan las desviaciones estándar (n = 3). b Descripción general del modelo YfkE visto a lo largo del plano de la membrana; las dos repeticiones de topología invertida, cada una con cinco hélices transmembrana, están coloreadas en naranja (TM1-TM5) y azul marino (TM6-10). Una hélice transmembrana (TM0) precede a la repetición N-terminal. Los sitios de unión para Ca2+ (esfera magenta) y Pi (esferas amarilla y roja) están formados por residuos en las llamadas alfa-repeticiones, es decir, TM2-TM3 y TM7-TM8. c Primer plano de la estructura hipotética del sitio de unión de Ca2+ y Pi en YfkE. Se destacan los residuos involucrados en la coordinación de iones. La red de interacción propuesta se indica con líneas negras. d Igual que c, con mapas de ocupación superpuestos calculados a partir del conjunto de modelos generados en este estudio. Específicamente, la figura muestra un contorno de los mapas de ocupación en un valor del 85 %, tanto para las cadenas laterales de proteínas (malla gris), Ca2+ (malla verde) y Pi (malla roja). Es decir, la porción de la estructura dentro de los contornos es más o menos consistente en el 85% del conjunto, mientras que la porción exterior es variable.

Habiendo establecido que la estructura existente YfkE que mira hacia adentro representa un estado unido a H+, en lugar de una conformación apo, procedimos a modelar los cambios en esta estructura que podrían explicar cómo el Ca2+ y el Pi monoaniónico se reconocen y transportan simultáneamente, después de H+ están descargados. Con ese fin, utilizamos un procedimiento similar al modelado de homología convencional, adaptado para considerar solo soluciones que satisfacen una serie de restricciones geométricas que reflejan los datos bioquímicos y funcionales que hemos obtenido para este antiportador (ver 'Métodos' para más detalles). El modelo también incorpora información derivada de una encuesta del Banco de datos de proteínas, específicamente de una proteína de estructura conocida que también reconoce Ca2+ y Pi al mismo tiempo, a saber, una hidrolasa dependiente de Ca2+ conocida como PON116. Esta proteína exhibe una estructura en forma de rosquilla con un sitio central donde se coordinan Ca2+ y Pi, que parece sorprendentemente similar al sitio de unión en YfkE y VCX1 (Fig. 8 complementaria).

Para explorar adecuadamente el rango de configuraciones de cadena lateral que son compatibles con los conjuntos de restricciones enumerados anteriormente, generamos un conjunto de 2000 modelos en total. Luego analizamos este conjunto conformacional utilizando un algoritmo de agrupamiento basado en la similitud por pares (consulte 'Métodos' para obtener más detalles). El modelo que se muestra en la Fig. 6b–d es representativo del grupo más poblado, que incluye ~52 % de todos los modelos producidos. Por diseño, el modelo muestra desviaciones mínimas en la conformación de la columna vertebral en relación con la estructura experimental del estado unido a H+. No obstante, parece claro que una reorganización de un número limitado de cadenas laterales es suficiente para producir un modelo que no solo es plausible químicamente sino que también es consistente con los datos experimentales existentes. Específicamente, el Ca2+ se coordina a través de interacciones bidentadas simultáneas con los grupos carboxilato de E72 y E255, así como con los carbonilos de G68 y N69. Pi está muy cerca y está coordinado por múltiples residuos que actúan como donantes de hidrógeno, además de H256, que parece estar preparado para actuar como aceptor. Si bien este modelo orientado hacia adentro es por definición hipotético, postulamos que proporciona un contexto estructural plausible para nuestros datos bioquímicos y fisiológicos y muestra que el reconocimiento simultáneo de Ca+ y Pi en un sitio compartido dentro de YfkE es completamente factible.

Las fluctuaciones en la concentración de Ca2+ citosólico son una estrategia de señalización celular universal. Sin embargo, la señalización mediada por Ca2+ no solo depende de la magnitud de los cambios en la concentración, sino también de la tasa específica, la frecuencia y los patrones espaciotemporales de esos cambios. La generación de estas señales complejas en respuesta a estímulos requiere la acción concertada de canales, transportadores y bombas de Ca2+ en la membrana plasmática y las membranas de los orgánulos intracelulares, para regular la entrada y salida de Ca2+9,17. En organismos unicelulares y plantas superiores, los antiportadores CAX proporcionan uno de los principales mecanismos para mantener este complejo equilibrio de Ca2+3,18.

En este estudio, revelamos un tipo de mecanismo regulador de CAX. Descubrimos que la actividad de intercambio H+/Ca2+ del homólogo bacteriano de CAX YfkE puede acelerarse en gran medida en presencia de Pi. Además, nuestros resultados usando vesículas de E. coli (Fig. 2a) y proteolipsomas reconstituidos (Fig. 2d) indican fuertemente que YfkE cotransporta Pi con Ca2+; es decir, se podría pensar que Pi es un "acompañante de transporte" que facilita la salida de Ca2+. Según nuestros ensayos de transporte, el acoplamiento de Ca2+ y Pi es altamente específico (Fig. 1 complementaria), pero estos dos iones exhiben una afinidad distinta, es decir, la KM aparente para Ca2+ es 0.15 mM (Fig. 1b), mientras que para Pi es 5 mM (Fig. 3c), lo que también se demuestra mediante los experimentos ITC (Fig. 2f). Esta disparidad puede ser un reflejo de sus diferentes concentraciones en las células. El [Ca2+] citosólico está estrechamente controlado por debajo de μM9,19, mientras que el Pi es mucho más abundante, tanto en células procariotas como eucariotas, entre 1 y 10 mM20,21. La abundancia de Pi citosólico debería permitir a YfkE cotransportar Ca2+ y Pi en condiciones fisiológicas típicas.

Pi no solo es un componente importante en los metabolismos celulares, sino que también sirve como molécula de señalización22. Hay varios sistemas de transporte de Pi disponibles para facilitar la homeostasis del fosfato. En bacterias y levaduras, proteínas específicas de unión a Pi responden a cambios en la disponibilidad de Pi ambiental en la membrana plasmática y transducen señales intracelulares para regular al alza la expresión de genes implicados en la captación de Pi23,24. Nuestro hallazgo de que la actividad de salida de Ca2+ de YfkE está regulada por la disponibilidad de Pi citosólico plantea la hipótesis de que las proteínas CAX están involucradas en la homeostasis tanto de Ca2+ como de Pi, dos iones esenciales en las células. Anteriormente se sugirió que YfkE participa en la esporulación en Bacillus subtilis25. Curiosamente, la acumulación de Ca2+ se encontró como una sal de fosfato de calcio en las esporas de Bacillus regresivas26. Es posible que YfkE utilice su actividad de cotransporte Ca/Pi para regular este proceso. Todas estas hipótesis requieren mayor investigación, pero vale la pena señalar que el cotransporte Ca2+-Pi se ha descrito tanto en bacterias como en plantas. Rosen et al. encontraron que la salida de Ca2+ en E. coli está mediada por dos sistemas de transporte, uno independiente de Pi y otro dependiente de Pi27. En Arabidopsis, la disrupción de los transportadores vacuolares de H+/Ca2+ CAX1 y CAX3 provoca alteraciones notables en el contenido de Pi28. Nuestros análisis bioquímicos, biofísicos y computacionales indican que YfkE reconoce Ca2+ y Pi en un sitio común, a través de interacciones directas o indirectas con residuos que se conservan entre muchas proteínas CAX, incluidas E72, E255, N69, N99, Q252, Q281 y H256 ( Figura complementaria 7). Por lo tanto, parece plausible que el mecanismo de cotransporte que observamos para YfkE pueda ser una característica común dentro de la familia CAX.

Si bien es probable que el mecanismo de transporte de YfkE y otras proteínas CAX se describa con precisión mediante el modelo de acceso alterno, una confirmación requerirá más información estructural más allá de los estados orientados hacia adentro existentes. Nuestros análisis funcionales y estructurales revelan un mecanismo regulador de YfkE activado por la disponibilidad de Pi citosólico. En ausencia o poca abundancia de Pi, YfkE funciona en un modo de intercambio H+/Ca2+ de bajo flujo de salida que involucra la competencia iónica por E72 y E255, los dos residuos de carboxilato en el sitio central (Fig. 7a). Tanto E72 como E255 son funcionalmente esenciales. Como se señaló, nuestros resultados computacionales muestran que YfkE transporta el H+ transportado en E255 y E72 (Tabla 2). Nuestros experimentos ITC (Fig. 5c-e) sugieren que la unión inicial de Ca2+ al estado orientado hacia adentro requiere el desplazamiento del enlace H+ en E255 pero no necesariamente en E72 (Tabla 2). Sin embargo, ambos protones deben liberarse antes de que el transportador pueda volver al estado orientado hacia el exterior. Por lo tanto, es posible que la desprotonación completa del sitio central luego de la unión de Ca2+ a una forma parcialmente protonada sea un factor limitante desde el punto de vista cinético.

a YfkE mantiene un modo de transporte de bajo flujo de salida en ausencia de Pi, en el que el acceso alterno de H+/Ca2+ desencadena la transición conformacional entre los estados hacia adentro y hacia afuera. b La presencia (o aumento) de Pi citosólico promueve YfkE a un modo de cotransporte H+/Ca-Pi de alto flujo. En ambos modos, E72 transfiere H+ (esfera verde) a E255 para disociar Ca2+ (esfera azul). En el modo de cotransporte, Pi (esfera roja) unida entre E255 y H256 adyacente a Ca2+ facilita la rotación del transporte.

La elevación de [Pi] citosólico cambia el transportador a un modo de alto flujo al acoplar el flujo de salida de Ca2+ al cotransporte de Pi, con ambos iones reconocidos de forma adyacente en el sitio central de la vía (Fig. 7b) como sugiere nuestro modelo de acoplamiento y estudios mutacionales (fig. 6). El mecanismo por el cual Pi acelera la salida de Ca2+ requiere más investigación. Cuando el Pi citosólico es lo suficientemente abundante, el Pi podría alterar la termodinámica de la reacción de intercambio H+/Ca2+, que sería energizada por el gradiente transmembrana externo de Pi además del gradiente H+ interno. Alternativamente, o además, la unión de Pi además de Ca2+ podría ayudar a acelerar la descarga completa de H+ del transportador, lo que le permite hacer la transición entre los estados hacia adentro y hacia afuera mientras se une a Ca2+. Esta hipótesis está respaldada por los análisis cinéticos en los que el acoplamiento de Pi conduce a un gran aumento de Vmax de Ca2+ transportado en 8x mientras que la afinidad de unión del Ca2+ transportado (KM) se reduce modestamente. Bound Pi no interactúa directamente con E72, según nuestro modelo estructural hipotético, pero está próximo a E255 (Fig. 6c, d). Por lo tanto, es posible que la liberación de H+ de E72 se produzca a través de E255, y que el Pi monoaniónico sirva como sitio de protonación transitorio entre E255 y H256, que luego descargaría el H+ en el citosol. Por lo tanto, Pi aceleraría la rotación del transporte al acelerar la disociación completa de H+ del estado orientado hacia adentro. Es de destacar que la Vmax del transporte de Pi alcanza su punto máximo a pH 7,5, que está muy cerca del pKa (7,2) del equilibrio entre las especies monoaniónica H2PO41− y dianiónica HPO42− (Fig. 3g). Curiosamente, también se ha propuesto un mecanismo de transferencia de H+ mediado por Pi (entre dos residuos de carboxilato) para un transportador de H+/fosfato29. Por tanto, es concebible que este tipo de mecanismos de salto de H+ sean comunes entre los transportadores acoplados a Pi. A pesar de la disponibilidad de múltiples estructuras de CAX11,12,13, la estequiometría de H+ frente a Ca2+ ha sido esquiva ya que su determinación sigue siendo un desafío técnico. En este estudio, encontramos que la actividad de transporte de un homólogo de CAX está regulada por la presencia de Pi, que en sí mismo es una especie protonable. Por lo tanto, se requerirá una caracterización cuidadosa del acoplamiento de H+ en cada modo de transporte para diseccionar la interacción entre Pi, Ca2+ y H+ en este mecanismo de intercambio.

YfkE pertenece a la superfamilia CaCA, que hasta el momento incluye más de 200 miembros en todos los dominios de la vida18. Todos los homólogos de CaCA presentan los dos motivos de secuencia conocidos como repeticiones α (TM2-3 y TM7-8) que presentan los dos residuos de carboxilato utilizados para la coordinación H+/Na+/Ca2+ (p. ej., E72 y E255 en YfkE). Sin embargo, estos motivos no se conservan estrictamente, y las variaciones de secuencia en ellos parecen modular la selectividad del sustrato de diferentes transportadores y, en última instancia, dictan si el ion de acoplamiento en el ciclo de intercambio es H+ o Na+11,12,13,30 (Fig. 9 complementaria) . En YfkE, la protonación de E72 y E255 en el estado orientado hacia el exterior permite que el transportador alcance la conformación orientada hacia el interior, que luego puede cargar Ca2+ citosólico (y Pi). E54 y E213, los dos residuos de carboxilato homólogos en el intercambiador de Na+/Ca2+ NCX_Mj, también pueden unir H+ en el estado orientado hacia el exterior, pero el transportador se inhibe31,32 ya que no puede acceder al estado orientado hacia el interior33, en línea con la hecho de que NCX_Mj no transporta H+ 30,33. Por el contrario, la unión de Na+ facilita esa transición conformacional que permite a NCX_Mj aprovechar el gradiente de Na+ hacia el interior. Por lo tanto, la correspondencia entre el transporte y la unión especifica no es trivial y requiere un mapeo de la energía del ciclo completo de acceso alterno. Además, las variaciones de secuencia también dan como resultado dependencias iónicas más complejas. Por ejemplo, en las células cerebrales, NCKX cataliza el cotransporte de K+ y Ca2+ a cambio de Na+. Esta dependencia de K+ se ha atribuido a un solo residuo de aspartato dentro de las segundas repeticiones α34. En las mitocondrias, el intercambiador de Na+/Ca2+ NCLX también puede transportar Li+ a cambio de Ca2+, y este modo de transporte depende de la sustitución de un único aminoácido en la segunda repetición35. Nuestros resultados sugieren que H256, conservado entre muchas proteínas CAX (y también en la segunda repetición) pero reemplazado por leucina/treonina en los intercambiadores de Na+/Ca2+ (Fig. 9 complementaria), es el residuo esencial que permite el cotransporte de Ca2+-Pi en Yfk E. Esta histidina no está presente en algunos CAX procarióticos, por ejemplo, en ChaA, un homólogo de CAX de E. coli, se encuentra un residuo de glicina en la posición equivalente (Fig. 9 complementaria). ChaA, sin embargo, es diferente de YfkE en que media el flujo de salida de K+ o Na+ acoplado a H+36,37. Por lo tanto, parece plausible que la actividad de cotransporte de Ca2+/Pi pueda estar presente en otros homólogos de CAX. En cualquier caso, nuestros hallazgos proporcionan evidencia adicional de que las proteínas CaCA alteran su selectividad de sustrato mediante el ajuste fino de los motivos de repetición α utilizados para el reconocimiento de Ca2+, lo que da como resultado diferentes mecanismos reguladores o energizantes en diferentes tipos de células.

Se prepararon vesículas de adentro hacia afuera (ISO) mediante un método de homogeneización a baja presión. Brevemente, se cultivaron células de E. coli BL21(DE3) que albergaban un vector pET28a-YfkE en medio de caldo Luria a 37 °C a A600 de 0,4. Las mutaciones se generaron utilizando un enfoque de mutagénesis dirigida al sitio estándar y se confirmaron mediante secuenciación. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,2 mM durante 2 ha 25 °C. Las células se lavaron con tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,3, KCl 140 mM, DTT 0,5 mM, sacarosa 250 mM. La ruptura celular se procesó mediante un solo paso a través de un homogeneizador C3 (Avestin) a baja presión (4000 psi). Después de eliminar los restos celulares por centrifugación, los sobrenadantes se centrifugaron usando un rotor Ti45 a 40 000 rpm durante 1 h para sedimentar las vesículas de membrana. Las vesículas se homogeneizaron en el mismo tampón y luego se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes de su uso.

Las actividades de transporte de Ca2+ y Pi de YfkE se midieron utilizando vesículas de adentro hacia afuera. Brevemente, las vesículas de membrana se diluyeron en un tampón (pH 8,0) que contenía los mismos componentes. Antes de los ensayos, se estableció un gradiente de H+ hacia el exterior añadiendo NADH 5 mM a las vesículas durante 10 min. Aunque es posible que en nuestras muestras haya una pequeña cantidad de vesículas con el lado derecho hacia afuera, la cadena de transporte de electrones en estas vesículas no puede activarse ya que el NADH es impermeable a la membrana. Por lo tanto, la única actividad medida es la de las vesículas de adentro hacia afuera. Para medir la actividad de transporte de Ca2+, también se añadió a las vesículas fosfato de potasio frío 5 mM. Para medir la actividad de transporte de fosfato, se añadió en su lugar CaCl2 frío 0,5 mM. Los ensayos de transporte se activaron añadiendo 45Ca2+ o 32P-Pi (Perkin Elmer) como se indica en las reacciones a temperatura ambiente. Las reacciones se terminaron por filtración a través de una membrana de nitrocelulosa (0,22 µm) en un colector de filtración Millipore y luego se lavaron inmediatamente con tampón. Los filtros se secaron al aire y se contaron en un contador de centelleo líquido para determinar la actividad de transporte. El análisis cinético se realizó ajustando los datos al modelo exponencial único de Michaelis-Menten utilizando el software Graphpad Prism 9. Para los ensayos de vesículas, se usaron como control vesículas de membrana preparadas con células BL21 (DE3) que albergaban un vector vacío. Para los ensayos cinéticos de mutantes, la concentración de vesículas se ajustó individualmente para obtener datos útiles para el ajuste del modelo.

Las proteínas de YfkE WT y variantes se expresaron y purificaron utilizando el mismo enfoque. Brevemente, la expresión de proteínas se llevó a cabo en la cepa E. coli C41 (DE3) en medio de autoinducción38 a 25 °C durante la noche. Las células se suspendieron en un tampón que contenía fosfato de Na 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e imidazol 20 mM y luego se rompieron mediante tres pases a través de un homogeneizador C3 (Avestin) a 15 000 psi. Las fracciones de membrana se recolectaron como se describe anteriormente y se suspendieron en lisis. buffer. Las fracciones de membrana se solubilizaron mediante la adición de n-dodecil-β-maltósido (DDM) al 1 % (p/v) a 4 °C durante 1 h y se incubaron con resina Ni-NTA (GE Healthcare). Las resinas se lavaron con tampón complementado con imidazol 60 mM y DDM al 0,05 % y luego se eluyeron con tampón complementado con imidazol 400 mM y DDM al 0,05 %. La proteína eluida se purificó adicionalmente utilizando una columna Superdex-200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada en un tampón que contenía HEPES 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM y DDM al 0,05 %.

Los proteoliposomas se prepararon usando lípidos totales de E. coli (Avanti polar lipids Inc.) de la siguiente manera: los lípidos solubilizados en cloroformo se secaron primero bajo gas inerte para formar una película lipídica delgada en un tubo de vidrio y luego se mantuvieron al vacío durante la noche para eliminar el cloroformo residual. A continuación, la película de lípidos se resuspendió en HEPES 20 mM (pH 7,4), NaCl 100 mM y luego se sonicó en hielo hasta que la suspensión se volvió transparente. Después de dos ciclos de congelación y descongelación, las grandes vesículas multilamelares generadas se pasaron a través de un filtro de policarbonato de 400 nm durante 11 veces para formar liposomas unilamelares utilizando una miniextrusora (Avanti Polar Lipids Inc). Antes de la reconstitución, los liposomas se desestabilizaron primero añadiendo 5 µl de Triton X-100 al 10 % (p/vol) por 1 mg de lípidos a temperatura ambiente durante 30 min. La proteína YfkE se mezcló con liposomas desestabilizados con detergente en una proporción de 1:10 (p:p) en hielo durante 20 min. El detergente se eliminó agregando bioperlas a la mezcla (80 mg de perlas para 1 ml de muestra) para formar proteoliposomas durante la noche a 4 °C con agitación suave. Al día siguiente, se añadieron bioperlas frescas durante otras 3 h para finalizar la reconstitución.

Para medir la actividad de transporte de Pi, se diluyeron 200 µl de proteoliposomas reconstituidos con 4 mg/ml de YfkE (pH = 7,4) en 400 µl de tampón que contenía HEPES 20 mM (pH = 8,0), NaCl 100 mM, 32P-fosfato 5 mM (Perkin Elmer) y CaCl _{2} 0,5 mM (o EDTA 2 mM como control) a temperatura ambiente. A los tiempos indicados, la reacción se terminó por filtración a través de una membrana de nitrocelulosa (0,22 µm) en un colector de filtración Millipore y luego se lavó inmediatamente con tampón. A continuación, los filtros se secaron al aire y se contaron en un contador de centelleo líquido para determinar la actividad de transporte.

Antes de los ensayos, se mezclaron 10 µg de proteínas YfkE marcadas con His purificadas con 100 µl de perlas de Ni-NTA. Se añadió 32Pi 40 mM a las perlas en presencia de Ca2+ 0,5 mM durante 10 min. Luego, las perlas se lavaron extensamente usando un tampón de proteína sin Pi. Las proteínas se eluyeron usando imidazol 250 mM y la radiactividad se midió usando un contador de centelleo.

Los cambios conformacionales de proteínas en el entorno de la membrana nativa se detectaron utilizando LRET en ISO. Para asegurar el etiquetado específico, dos residuos de cisteína endógenos (C34 y C293) se sustituyeron con valina usando mutagénesis dirigida al sitio para generar una construcción YfkE libre de cisteína. A continuación, se introdujeron un par de residuos de cisteína para el marcado con fluoróforo: se insertó un residuo de cisteína C3 en el extremo N-terminal y se colocó otro residuo de cisteína en la posición 56 o 202 en función de la estructura YfkE. Una secuencia flanqueante amino-terminal inmediatamente después de C3 incluye una etiqueta His6 para aumentar la distancia entre el donante y el receptor para señales LRET óptimas y un sitio de escisión de trombina para la normalización de fondo.

ISO se preparó utilizando el enfoque descrito anteriormente. El marcaje de vesículas se llevó a cabo usando química reactiva con tiol durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad usando 200 nM de derivado de maleimida de fluoróforos donantes y aceptores. Los fluoróforos utilizados son quelato de terbio (Invitrogen) y Atto-465 (Sigma). Después del etiquetado, las vesículas se dializaron dos veces frente a un tampón que contenía HEPES 10 mM pH 7,3, KCl 140 mM y sacarosa 250 mM durante 2 ha 4 °C para eliminar el exceso de sondas. Antes del escaneo de fluorescencia, se mezclaron con vesículas CaCl _{2} 0,5 mM y/o fosfato de potasio 5 mM (pH 7,3).

Las mediciones de fluorescencia se realizaron utilizando un espectrómetro de vida útil de fluorescencia basado en cubetas QuantaMaster modelo QM3-SS (Photon Technology International). Cada experimento se informa como un promedio de tres mediciones para un estado dado, y cada medición tiene un promedio de 99 pulsos de la lámpara de destellos. Los datos se recopilaron utilizando el software Fluorescan (Photon Technology International) y se analizaron utilizando el software Origin (OriginLab Corp). La emisión sensibilizada del aceptor se detectó antes y después de la escisión de la trombina, una técnica bien establecida que se utiliza para sustraer la fluorescencia de fondo39,40,41. Específicamente, después de obtener las mediciones del tiempo de vida del aceptor, se añadieron cinco unidades de trombina bovina (Calbiochem) a la cubeta y se permitió que escindiera el fluoróforo marcado N-terminal. La escisión se completó de 1 a 3 h después de la adición de trombina. La muestra marcada como donante-aceptor se excitó a 337 nm y la emisión se detectó a 508 nm. Las distancias se calcularon utilizando la ecuación de Förster (Ec. (1)):

La afinidad de unión de Ca2+ y Pi se determinó usando calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Las proteínas se descalcificaron mediante la adición de EGTA 10 mM y luego se separaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La solución de Ca2+ o Pi se preparó en el mismo tampón. Los ensayos de ITC se realizaron valorando Ca2+ en una solución de proteína YfkE 5 o 10 μM en un dispositivo VP-ITC (Microcal LLC). Todos los ensayos utilizaron el mismo programa ITC: el sistema se equilibró térmicamente a 25 °C; después de un retraso inicial de 120 s, se realizaron inyecciones en serie (10 μl cada una) con un tiempo de espaciamiento de 240 s a una velocidad de agitación de 307 rpm. Cada medición se corrigió con una titulación de fondo en la que el ligando se tituló en una solución tampón. El ajuste de datos se realizó utilizando el software Origin (Microcal LLC).

Las simulaciones se basaron en la estructura cristalina de YfkE (PDB 4KJR)12 orientado hacia adentro. Todas las simulaciones se realizaron con NAMD 2.942 utilizando el campo de fuerza CHARMM36 para proteínas y lípidos43,44. Todas las simulaciones se realizaron a temperatura constante (298 K) y presión semi-isotrópica (1 atm), utilizando condiciones de contorno periódicas y un paso de tiempo de integración de 2 fs. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon utilizando PME, con un límite de espacio real de 12 Å. Las interacciones de Van der Waals se calcularon con un potencial de Lennard-Jones, de corte a 12 Å con una función de conmutación suave que tuvo efecto a 10 Å. La construcción de proteína específica estudiada es un solo protómero que incluye los residuos 1-177 (TM-TM5) y los residuos 200-351 (TM6-TM10); el bucle citoplasmático aparentemente no estructurado que conecta TM5 y TM6 estaba truncado. La construcción de proteína se incrustó en una bicapa lipídica de palmitoil-oleoil-fosfatidil-colina (POPC) hidratada previamente equilibrada utilizando GRIFFIN45 y se encerró en una caja ortorrómbica de ~ 88 × 88 × 95 Å de tamaño. El sistema de simulación resultante contiene aproximadamente 76 700 átomos, incluidas 207 moléculas de lípidos y un tampón KCl 100 mM (Fig. 6 complementaria). El sistema de simulación se equilibró siguiendo un protocolo por etapas que comprende una serie de trayectorias MD en las que las restricciones posicionales y conformacionales que actúan sobre la estructura de la proteína se debilitan gradualmente durante 100 ns. Para evaluar el estado de protonación de una cadena lateral dada en la proteína frente a una referencia de pKa conocido, se incluyó en el sistema de simulación un aminoácido del mismo tipo libre en solución. Este aminoácido se neutralizó en el extremo N-terminal con una modificación de acetilo y en el extremo C-terminal con una amida secundaria, para aislar la energía de protonación de la cadena lateral. A lo largo de las simulaciones, el aminoácido libre se mantuvo en solución y se mantuvo alejado de todos los demás solutos (proteínas, membranas, iones) a través de un conjunto de potenciales repulsivos que actúan a cierta distancia umbral. Se introdujeron topologías duales (protonadas y desprotonadas) tanto para la cadena lateral de la proteína como para su equivalente en solución. Luego se usó el algoritmo de perturbación de energía libre (FEP) para alterar los estados de protonación de ambas cadenas laterales, al mismo tiempo pero en direcciones opuestas; por lo tanto, el valor de energía libre resultante refleja el aumento o la disminución en la propensión a la protonación de la cadena lateral de la proteína con respecto a lo que es intrínseco para ese tipo de cadena lateral en solución (Fig. 6 complementaria). Esta transformación se llevó a cabo en ambas direcciones, es decir, protonación de la cadena lateral de la proteína y desprotonación del aminoácido libre, y viceversa. Los valores de ΔΔG que se muestran en la Tabla 2 reflejan el valor medio de estos dos cálculos; la media diferencia se proporciona como una barra de error. Cada cálculo consistió en una serie de simulaciones MD consecutivas en las que un parámetro l cambia de 0 a 1 (o viceversa) a medida que una topología se reemplaza gradualmente por la otra, mientras que los cambios correspondientes en energía potencial se anotan para cada instantánea de simulación. Cada transformación l se discretizó en 40 pasos, cada uno de los cuales consistió en una simulación de 1 ns, para cadenas laterales en el interior de la proteína, o 240 ps, ​​para las cadenas laterales de superficie más móviles. Estas 40 simulaciones se realizaron secuencialmente; después de cada cambio incremental en l, un fragmento de trayectoria (200 o 40 ps, ​​respectivamente) se consideró como tiempo de equilibrio y se omitió del cálculo de energía libre.

Analizamos estructuras de rayos X de proteínas que cumplen los siguientes criterios: (i) la resolución es de 3,0 Å o mejor; (ii) la identidad de secuencia con una estructura previamente seleccionada es inferior al 70%; (iii) las estructuras tienen un ión de calcio y otro de fosfato unidos, en un sitio de unión común (es decir, la distancia mínima entre los dos iones es de 3,2 Å o menos); y (iv) el sitio de unión está flanqueado por dos cadenas laterales ácidas y una de histidina, como en YfkE. Esta encuesta dio como resultado una estructura, a saber, la de la paraoxonasa 1 de suero de mamífero (PON1), una hidrolasa dependiente de calcio (entrada PDB 3SRE)46.

El modelo molecular de YfkE unido a Ca2+ y fosfato se generó con MODELLER v9.1347. El procedimiento seguido fue similar al utilizado en el modelado de homología, excepto que aquí el objetivo era la estructura desconocida del estado unido a Ca2+/fosfato, y la plantilla era la estructura conocida (PDB 4KJR)12. Solo se remodeló la estructura de las cuatro hélices TM que flanquean el sitio de unión (las llamadas repeticiones α, es decir, los residuos 59–110 y 239–296). Para modelar específicamente la geometría del sitio de unión, con unión de Ca2+ y fosfato, agregamos un conjunto de restricciones geométricas deducidas de las estructuras mencionadas anteriormente de PON1 y NCX_Mj16,30, y estudios de transporte de Ca2+/fosfato de formas mutadas y de tipo salvaje de YfkE . Específicamente, estos últimos han demostrado que las siguientes mutaciones provocan cambios significativos en los valores medidos de KM y/o Vmax, sin anular el transporte: G68A, N69A, N99A, N252A, H256A y Q281A. Por lo tanto, se aplicaron restricciones a las siguientes distancias entre el Ca2+ y la proteína, utilizando un potencial armónico que actúa a distancias iguales o superiores a 2,6 Å (y una 'desviación' de 0,1 Å): (1) a cada uno de los cuatro átomos de oxígeno de los grupos carboxilato de E72 y E255; (2) al más cercano de los átomos de oxígeno del fosfato (modelado como H2PO4−); (3) al carbonilo de G68; y (4) al oxígeno carbonilo de la cadena lateral N69. En conjunto, estas cuatro restricciones implican un número de coordinación de Ca2+ de 7. Se aplicaron restricciones análogas a las distancias entre el átomo de fósforo y (5) Nδ de H256 a 3,9 Å, (6) Cγ de N252 (4,5 Å) y (7) ) Cγ de S278 (4,5 Å); ya la distancia entre (8) Oε de Q281 y Nδ de N69 (3,2 Å).; y (9) entre Cγ de N252 y Cγ de N99 (4,2 Å). Finalmente, para imponer interacciones bidentadas dobles entre Ca2+ y E72 y E255, también se aplicó una restricción a (10) los ángulos diedros formados por Ca2+ y los átomos Cδ, Oε1 y Oε2 de E72 y E255 (0°, con ~ 20° de desviación). Generamos un conjunto de 2000 modelos en total y analizamos este conjunto mediante agrupamiento basado en RMSD por pares; este cálculo de RMSD incluyó todos los átomos que no son de hidrógeno de los residuos N69, E72, N99, N252, E255, H256, S278 y Q281, además de los iones Ca2+ y fosfato, y los grupos se definieron por un valor umbral de RMSD de 0,6 Å. De este análisis resultaron 15 clusters que comprenden más de 10 modelos, que suman el 92% de los modelos.

Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces (n = 3) para garantizar la reproducibilidad de los datos. Todos los puntos de datos y barras de error (desviaciones estándar) se proporcionan en cada figura y datos complementarios, si corresponde.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria). Los datos de origen de las cifras se pueden encontrar en Datos complementarios 1.

Los archivos para la simulación MD están disponibles en https://github.com/Faraldo-Gomez-Lab-at-NIH/Download.

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Damos las gracias a Mousheng Wu para la fase inicial de este estudio. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Grant R01GM143418 y American Heart Association Grant 18TPA34230046 para LZJDF-G. está financiado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, NIH. Los recursos computacionales fueron proporcionados en parte por la instalación de computación científica Biowulf de los NIH.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Centro de Biología de Membranas, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en la Escuela de Medicina Houston McGovern, Houston, TX, EE. UU.

Wei Niu, Shuo Lu, Trung Vu, Vasanthi Jayaraman y Lei Zheng

Laboratorio de Biofísica Molecular Teórica, Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.

Wenchang Zhou & José D. Faraldo-Gómez

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Conceptualización: JDF-G. y LZ; análisis: WN, WZ, SL, TV, VJ, JDF-G. y LZ; investigación: WN, SL, WZ, TV y VJ; redacción—preparación del borrador original: JDF-G. y LZ; redacción—revisión y edición: todos los autores; supervisión: JDF-G. y LZ; administración del proyecto: JDF-G. y LZ; financiación adquisición: JDF-G. y LZ todos los autores han leído y aceptado el manuscrito.

Correspondence to José D. Faraldo-Gómez or Lei Zheng.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Janesh Kumar y Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Niu, W., Zhou, W., Lu, S. et al. Salida de Ca2+ facilitada por el cotransporte del anión fosfato inorgánico en el antiportador H+/Ca2+ YfkE. Commun Biol 6, 573 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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Recibido: 19 mayo 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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