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Sep 02, 2023

Aβ1

Psiquiatría Molecular

Psiquiatría molecular (2023)Citar este artículo

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La enfermedad de Alzheimer (EA), la principal causa de demencia en adultos mayores, es una proteinopatía doble caracterizada por una patología amiloide-β (Aβ) y tau. A pesar de los enormes esfuerzos que se han realizado en las últimas décadas para encontrar terapias efectivas, las intervenciones farmacológicas tardías a lo largo del curso de la enfermedad, las metodologías clínicas inexactas en el enrolamiento de pacientes y los biomarcadores inadecuados para evaluar la eficacia de los medicamentos no han permitido el desarrollo de un método efectivo. estrategia terapéutica. Los enfoques seguidos hasta ahora para desarrollar fármacos o anticuerpos se centraron únicamente en la orientación de la proteína Aβ o tau. Este artículo explora la capacidad terapéutica potencial de un péptido sintético de isómero D limitado a los primeros seis aminoácidos de la secuencia N-terminal del Aβ mutado en A2V, Aβ1-6A2V(D), que se desarrolló tras la observación de un caso clínico que sirvió de base para su desarrollo. Primero realizamos una caracterización bioquímica en profundidad que documenta la capacidad de Aβ1-6A2V(D) para interferir con la agregación y la estabilidad de la proteína tau. Para abordar los efectos in vivo de Aβ1-6A2V(D) contra el deterioro neurológico en ratones genéticamente predispuestos o adquiridos con alto riesgo de EA, probamos sus efectos en animales transgénicos triples que albergaban PS1(M146 V), APP(SW) y MAPT(P301L) humanos. ) transgenes y ratones de tipo salvaje envejecidos expuestos a una lesión cerebral traumática (TBI) experimental, un factor de riesgo reconocido para la EA. Descubrimos que el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) en ratones TBI mejoró los resultados neurológicos y redujo los marcadores sanguíneos de daño axonal. Aprovechando el modelo de C. elegans como biosensor de la toxicidad de las proteínas amiloidogénicas, observamos un rescate de defectos locomotores en nematodos expuestos a homogeneizados de cerebro de ratones TBI tratados con Aβ1-6A2V(D) en comparación con controles TBI. Mediante este enfoque integrado, demostramos que Aβ1-6A2V(D) no solo impide la agregación de tau sino que también favorece su degradación por las proteasas tisulares, lo que confirma que este péptido interfiere con la propensión y proteotoxicidad de agregación de Aβ y tau.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una proteinopatía doble caracterizada por patología amiloide-β (Aβ) y tau y es la demencia más común en adultos mayores [1, 2]. A pesar de los enormes esfuerzos que se han realizado en las últimas décadas para encontrar una terapia eficaz, todavía hay pocas armas disponibles para combatir esta enfermedad. Recientemente, Lecanemab, un anticuerpo monoclonal humanizado que se une con alta afinidad a las protofibrillas solubles Aβ, fue aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. para el tratamiento de pacientes con EA con deterioro cognitivo leve o demencia leve [3]. Desde la aprobación de aducanumab [4], este es el segundo anticuerpo aprobado para esta enfermedad. Quedan por establecerse los beneficios asociados con el uso de esta clase de medicamentos. Son muy costosos y requieren un seguimiento continuo de los pacientes, lo que implica un gasto considerable de recursos para el sistema sanitario. Además, todavía existe un gran debate sobre la capacidad de estos anticuerpos, particularmente aducanumab, para inducir pequeñas hemorragias cerebrales y anomalías en las imágenes relacionadas con el amiloide asociadas con edema cerebral y trastornos neurológicos [5]. Por lo tanto, está claro que la EA sigue siendo una enfermedad incurable [6]. Las razones del fracaso constante de más de 400 ensayos farmacológicos para la EA no están claras y seguramente no son fáciles de dilucidar. Diferentes factores pueden haber contribuido a sus fallas, incluidas las intervenciones terapéuticas tardías a lo largo del curso de la enfermedad, metodologías clínicas inexactas en la inscripción de pacientes y biomarcadores inadecuados para evaluar la eficacia del fármaco [6,7,8,9,10,11].

Una de las principales limitaciones de los enfoques utilizados hasta ahora en el tratamiento de la EA es el diseño de fármacos modificadores putativos para dirigirse solo a Aβ, sin dirigirse a tau, que también participa activamente en el inicio y la progresión de la EA [1, 2]. Aunque se sabe desde hace mucho tiempo que, en la condición de la enfermedad, las especies tau pueden viajar de una célula a otra, propagando la patología neurodegenerativa, solo recientemente esta proteína se ha considerado un objetivo farmacológico [12, 13]. En los últimos 15 años, se han desarrollado y probado varios enfoques terapéuticos dirigidos a formas patológicas de tau, principalmente inhibidores de la agregación de tau y anticuerpos monoclonales anti-tau [10]. Algunos fueron efectivos cuando se probaron in vitro e in vivo en modelos animales con DA [13]. Sin embargo, para los compuestos dirigidos a Aβ, no mostraron eficacia clínica. Dirigirse a una sola proteína no es una estrategia ganadora para combatir una enfermedad compleja como la EA. El desarrollo de una terapia multiobjetivo capaz de actuar contra Aβ y tau puede representar un enfoque farmacológico innovador.

Recientemente, hemos propuesto una nueva estrategia bioinspirada en la EA derivada del descubrimiento clínico de que la presencia de la sustitución A2V en el dominio N-terminal del propio Aβ desempeña un papel protector en la amiloidogénesis al afectar la velocidad de progresión del ensamblaje de proteínas y la cinética de agregación. [14,15,16]. Sobre estas bases, proponemos el diseño de un péptido sintético de isómero D limitado a los primeros seis aminoácidos de la secuencia N-terminal del Aβ mutado en A2V, Aβ1-6A2V(D) [17]. Este péptido corto interactúa con Aβ de tipo salvaje de longitud completa, lo que interfiere con la generación de oligómeros, la formación de fibrillas y la acumulación de amiloide [18, 19]. También interfiere con la neurotoxicidad dependiente de Aβ y la disfunción sináptica en modelos animales y revierte la sinaptopatía in vitro e in vivo inducida por Aβ [16, 20,21,22]. Además, simulaciones de dinámica molecular realizadas por nuestro grupo y otros científicos independientes mostraron que la actividad anti-amiloidogénica del péptido Aβ1-6A2V(D) está relacionada con su flexibilidad estructural, lo que facilita la interacción heterotípica con Aβ, dificultando su ensamblaje [15]. , 23, 24].

Presumimos que la acción protectora natural contra la EA ejercida por la sustitución A2V no se limita solo a la interacción con Aβ sino que también podría implicar efectos sobre tau. En consecuencia, la eficacia in vivo contra la EA del péptido Aβ1-6A2V(D) bioinspirado podría deberse a efectos adicionales que no son Aβ asociados con el direccionamiento de tau.

Para probar nuestra hipótesis de trabajo, en este estudio primero evaluamos la capacidad del hexapéptido sobre la agregación y la estabilidad de tau recombinante. Para investigar el efecto de Aβ1-6A2V(D) sobre la toxicidad de tau, utilizamos Caenorhabditis elegans como biosensor [25,26,27]. Este nematodo es capaz de detectar específicamente ensamblajes tóxicos de tau, particularmente ensamblajes oligoméricos, incluso cuando se administra de forma exógena, lo que resulta en un deterioro neuromuscular. Mediante la administración de homogeneizados de cerebro de ratones transgénicos P301L, un modelo animal bien caracterizado de tauopatía, a C. elegans, demostramos un defecto neuronal al observado con tau recombinante oligomérica [27]. Este enfoque bien validado proporciona una herramienta útil para la detección de posibles agentes farmacológicos [27]. Para probar la relevancia del tratamiento con Aβ1-6A2V(D) para la EA y otras demencias relacionadas con la patología tau, utilizamos nuestro modelo preclínico establecido de lesión cerebral traumática (TBI) [28, 29]. En humanos, TBI precipita la patología tau con un perfil de isoformas y un estado de fosforilación similar a la EA [30]. Previamente mostramos que, al igual que en la EA y otras taupatías, en la LCT se generan formas anormales de tau con propiedades similares a las de los priones y contribuyen a la neurodegeneración tardía y al deterioro cognitivo [28]. También demostramos que la exposición de gusanos a homogeneizados cerebrales de ratones TBI indujo una disfunción locomotora progresiva con daño neuromuscular y deterioro de la neurotransmisión postsináptica [26]. Es importante destacar que la administración de anticuerpos anti-tau rescató los déficits motores [26]. Esto indica el papel causal de la tau generada por TBI mal plegada/agregada en la toxicidad y apoya el nematodo y nuestros modelos de ratón TBI para la evaluación de Aβ1-6A2V(D) como un nuevo agente terapéutico en formas adquiridas de EA.

Hace tiempo que se reconoce un mayor riesgo de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluida la EA, después de la exposición a TBI, y se estima que entre el 5 y el 10 % de la demencia en la comunidad está asociada con TBI [31,32,33]. Como tal, TBI es un factor de riesgo principal para enfermedades neurodegenerativas. Es importante destacar que la neurodegeneración posterior a una TBI presenta una oportunidad singular para estudiar el curso temporal y los impulsores de la patología de la demencia desde un punto definido en el tiempo. Creemos que nuestro enfoque proporcionará información sobre las propiedades terapéuticas de Aβ1-6A2V(D) no solo para la EA sino también para otras tauopatías como la neurodegeneración inducida por TBI y la demencia asociada.

Aβ1-6A2V(D) (DVEFRH), TAT48-56(D) (GRKKRRQRRR) y Aβ1-6A2V(D)-TAT (DVEFRH-GGGG-GRKKRRQRRR) se sintetizaron mediante síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador Alstra automatizado ( Biotage, Uppsala, Suecia) a una escala de 0,1 mM con resina NOVASYN-TGA (Novabiochem, Darmstadt, Alemania) utilizando D-aminoácidos protegidos con Fmoc (Sigma Aldrich, Laufelfingen, CH) [16]. Los aminoácidos se activaron mediante una reacción con tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio y N,N-diisopropiletilamina. Se incluyó un paso de protección con anhídrido acético después del último ciclo de acoplamiento de cada aminoácido. El péptido se escindió de la resina con ácido trifluoroacético/tioanisol/agua/fenol/etanoditiol (82,5:5:5:5:2,5 vol/vol), se precipitó y se lavó con éter dietílico. Los péptidos se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa en una columna C18 semipreparativa (Waters Corporation, Milford, MA) y se confirmó su identidad con un espectrómetro MALDI-TOF (Applied Biosystems, Concord, Ontario, Canadá) . A continuación, las muestras se liofilizaron y almacenaron a -20 °C hasta su uso. La pureza del péptido fue superior al 95%.

Se obtuvieron ratones macho JNPL3 que expresaban tau humana 0N4R con la mutación P301L (P301L) de Taconic Biosciences (Nueva York, EE. UU.) (Tau Model 2508). Los controles eran ratones macho no transgénicos (no tg) con el mismo antecedente genético mixto C57BL/6, DBA/2, SW que los ratones P301L. El Dr. Oddo [34] proporcionó amablemente ratones transgénicos triples que albergaban transgenes humanos PS1 (M146 V), APP (SW) y MAPT (P301L), denominados 3xTg-AD. Se adquirieron ratones macho y hembra C57BL/6 J, denominados de tipo salvaje (WT), de Envigo (Italia).

Los ratones se alojaron en una habitación específica para animales libre de patógenos a una temperatura constante de 21 ± 1 °C, humedad de 60 ± 5 %, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y acceso ad libitum a alimento y agua.

Los procedimientos relacionados con los animales y su cuidado se realizaron de conformidad con las directrices institucionales en el Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS en cumplimiento de las normas nacionales (D.lgs 26/2014; Autorización n. 19/2008-A emitida el 6 de marzo de 2008, por Ministerio de Salud); Normas y Políticas Institucionales Mario Negri que otorgan autorización interna a las personas que realizan experimentos con animales (Certificado del Sistema de Gestión de la Calidad – UNI EN ISO 9001:2015 – Reg. N° 6121); la Guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (edición de 2011) y las directivas y directrices de la UE (Directiva del Consejo de la CEE 2010/63/UE). Las instalaciones para animales cumplen con los estándares internacionales y son revisadas regularmente por un veterinario certificado que es responsable del control de la salud, la supervisión del bienestar animal, los protocolos experimentales y la revisión de los procedimientos.

Todos los experimentos con animales fueron diseñados según las pautas ARRIVE [35], con el compromiso de refinar, reducir y reemplazar, minimizando la cantidad de ratones, mientras usamos bioestadística para optimizar la cantidad de ratones como en nuestro trabajo anterior usando el modelo TBI de ratón [28, 36, 37]. Por lo tanto, para la validez estadística, utilizamos de 8 a 10 ratones para las pruebas de comportamiento y de 6 a 10 ratones para el análisis bioquímico y de biomarcadores.

Brevemente, el impacto cortical controlado se indujo sobre la corteza parietotemporal izquierda de ratones 3xTg-AD de 2 meses de edad o ratones WT envejecidos (24 meses de edad). Los ratones se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano (inducción al 3 %; mantenimiento al 1,5 %) en una mezcla de N2O/O2 (70 %/30 %) y se colocaron en un marco estereotáxico. Luego, los ratones se sometieron a craniectomía, seguida de la inducción de una lesión cerebral por impacto cortical controlada, como se describió anteriormente [36]. Brevemente, la lesión se indujo usando un impactador rígido de 3 mm impulsado por un dispositivo de impacto controlado electromagnéticamente (Impact OneTM; Leica, Buffalo Grove, IL, EE. UU.) montado rígidamente en un ángulo de 20° desde el plano vertical y aplicado a la zona expuesta. duramadre, entre bregma y lambda, sobre la corteza parietotemporal izquierda (anterior-posterioridad: −2,5 mm, lateralidad: −2,5 mm), a una velocidad del impactador de 5 m/s y una profundidad de deformación de 2 mm, lo que resulta en un nivel severo de lesión [38]. Luego se cubrió la craneotomía con craneoplastia y se suturó el cuero cabelludo. Los ratones falsos de la misma edad recibieron anestesia y cirugía idénticas sin lesión cerebral. Los ratones vírgenes (a los 2 meses de edad) no se sometieron a ningún procedimiento experimental.

El Aβ1-6A2V(D) se administró a 3xTg-AD y los ratones WT TBI de 24 meses de edad se sometieron a administración intranasal repetida como se describe en [39]. En resumen, los ratones se aclimataron durante 2 semanas antes de la cirugía y el tratamiento. Se administró Aβ1-6A2V(D) a ratones a 50 mg/kg de peso corporal (p.c.) (alrededor de 5 µL/fosa nasal/ratón, 10 µL en total/cada sesión de tratamiento/ratón) comenzando 10 min después de la TBI y cada 48 h hasta 6 días después de la lesión, usando una pipeta de 20 µL y una punta de pipeta de carga de gel. En cada sesión de tratamiento, los ratones se mantuvieron en su lugar durante 30 segundos después de la primera administración de 5 µL y luego se les dejó moverse libremente en una jaula durante 30 segundos antes de administrar el resto del tratamiento/vehículo [39]. El peso se evaluó antes de cada administración intranasal. Las funciones neurológicas se monitorearon longitudinalmente y los niveles plasmáticos de luz de neurofilamento (NfL) se evaluaron en el sacrificio como se detalla en la Información complementaria (secciones 'Prueba de comportamiento' y 'Luz de neurofilamento plasmático'). Siete días después de la cirugía, se sacrificaron los ratones, se extrajo el cerebro y se disecaron las áreas corticales ipsilaterales, se congelaron inmediatamente en hielo seco y se almacenaron a -80 °C hasta su uso para estudios bioquímicos y de C. elegans. A las 4 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la cirugía, se sacrificó un subconjunto de ratones (n = 3), y se extrajeron sus cerebros, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta que la matriz- análisis de imágenes de desorción/ionización láser asistida (MALDI). Los investigadores estaban cegados a la asignación del tratamiento durante la evaluación de los resultados.

Los nematodos Bristol N2 se obtuvieron del Centro Genético Caenorhabditis elegans (CGC, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.) y se propagaron a 20 °C en medio de crecimiento de nematodos sólido (NGM) sembrado con E. coli OP50 (CGC) para alimento. Utilizamos la técnica de blanqueamiento para preparar animales sincronizados por edad [40]. A continuación, se transfirieron C. elegans en el primer estadio larvario a placas NGM frescas y se cultivaron a 20 °C. En el estado larvario L3-L4, los nematodos se recolectaron con tampón M9, se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS 10 mM (pH 7,4) para eliminar las bacterias. Los gusanos se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con agitación orbital, en ausencia de E. coli, con homogeneizados de cerebro de ratones Non-tg y P301L (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL 10 mM PBS, pH 7,4) en el presencia o ausencia de Aβ1-6A2V(D) 50 µM, TAT 50 µM o Aβ1-6A2V-TAT(D) 0,1–200 µM. Los gusanos de control se trataron con PBS 10 mM, pH 7,4 (vehículo), Aβ1-6A2V (D) 50 µM, Aβ1-6A2V-TAT (D) 50 µM o TAT 50 µM (100 gusanos/100 µL). Se administraron homogeneizados de tejido pericontusional de ratones WT TBI jóvenes 12 meses después de la lesión o ratones simulados de la misma edad a gusanos (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL) en ausencia o presencia de 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) . Homogeneizados de tejido pericontusional de ratones 3xTg-AD TBI, así como tejidos pericontusionales de ratones WT TBI envejecidos, previamente tratados o no con 50 mg/kg bw Aβ1-6A2V(D) intranasal, y sacrificados 7 días después de la lesión (tiempo en el que ambos 3xTg-AD y ratones TBI envejecidos mostraron deterioro cognitivo), se administraron a gusanos (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL de PBS 10 mM, pH 7,4). Se administraron homogeneizados de ratones ingenuos o simulados a gusanos como controles para ratones 3xTg-AD y WT TBI envejecidos, respectivamente ((30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL de PBS 10 mM, pH 7,4). Como control negativo adicional, 10 mM Se administró PBS, pH 7,4 (100 gusanos/100 µL) a los nematodos. Luego, los gusanos se sembraron en placas NGM sembradas con OP50 E. coli, se cultivaron a 20 °C y se transfirieron todos los días a nuevas placas NGM sembradas con E. coli para evitar la superposición de generaciones.La actividad locomotora de los nematodos se calificó 7 días después del tratamiento en condiciones ciegas y se expresó como el cuerpo se dobla/min [26].

Los experimentos con C. elegans se realizaron con 100 gusanos por grupo y se repitieron al menos tres veces según los métodos descritos en http://www.wormbook.org. No se requirió aleatorización para los experimentos con C. elegans. Para los estudios de eficacia, los ratones se asignaron a los diferentes grupos experimentales utilizando listas de aleatorización (www.randomizer.org). Todas las evaluaciones se realizaron de forma ciega al grupo de tratamiento y la identidad de la muestra. Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism 9.0 (CA, EE. UU.) mediante la prueba t de Student, ANOVA de una o dos vías y la prueba post hoc de Bonferroni o Tukey. Los valores de IC50 se determinaron usando el mismo software. Se consideró significativo un valor de p < 0,05. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías para medidas repetidas en el caso de evaluaciones longitudinales (prueba SNAP), seguido de una prueba post hoc de Sidak.

Para explorar el potencial multiobjetivo del péptido Aβ1-6A2V(D), llevamos a cabo una serie de estudios destinados a evaluar su capacidad para contrarrestar la agregación y la toxicidad de tau. Utilizamos tau recombinante producida en E. coli, que carece de modificaciones postraduccionales que normalmente están presentes en tau humana. La cinética de la agregación de tau se controló utilizando el ensayo de fluorescencia de tioflavina-T (ThT) y empleando heparina como coagregante [41, 42]. Se incubó tau recombinante diez µM en forma mutada con P301L (Tau P301L) a 37 °C con diferentes proporciones molares de tau a péptido (1:4, 1:8 y 1:16), en presencia de heparina. El péptido redujo significativamente la propensión a la agregación de Tau P301L a partir de una proporción molar de tau:Aβ1-6A2V(D) de 1:8, y se observó una inhibición casi completa de la agregación a una proporción molar de 1:16, según lo determinado por el análisis ThT ( Figura 1A). A continuación, se seleccionó la proporción molar de 1:8 de tau a péptido como la óptima para estudios adicionales. El análisis de ThT indicó que Aβ1-6A2V(D) 16 µM redujo significativamente la propensión a la agregación no solo de Tau P301L 2 µM sino también de Tau de tipo salvaje (WT) (Fig. 1B, C). Para confirmar estos resultados, ambas isoformas de tau recombinante se sometieron a análisis de microscopía de fuerza atómica antes (T0) y 24 h (T24) después de la incubación con el péptido en las mismas condiciones experimentales descritas anteriormente (Fig. 1D, E). Estos datos confirman que el péptido inhibe la agregación de tau, también en su forma P301L mutada, que se sabe que es más propensa a plegarse incorrectamente.

A La propensión a la agregación de tau P301L 10 µM se evaluó mediante un ensayo ThT fluorométrico en tampón de fosfato (PB) 10 mM, pH 7,4, que contenía una heparina (proporción tau/heparina de 4:1 (p/p)) y ditiotreitol 5 mM ( TDT). La fluorescencia de ThT se midió durante la incubación a 37 °C en ausencia (Tau P301L) y presencia de Aβ1-6A2V(D) en una proporción molar de tau a péptido de 1:8 o 1:16. Cada valor representa la media ± SE de tres experimentos diferentes (N = 3) y se expresa en unidades arbitrarias (au). La propensión a la agregación de 2 µM (B) Tau P301L y (C) Tau WT se evaluó mediante el ensayo ThT midiendo la intensidad de la fluorescencia durante la incubación a 37 °C en presencia de 16 µM Aβ1-6A2V(D) o el mismo volumen de PB, pH 7,4 (Vehículo). Cada valor representa la media ± SE de 3 experimentos diferentes (N = 4) y se expresa en unidades arbitrarias (au). D, E Se obtuvieron imágenes representativas de microscopía de fuerza atómica en muestras de tau inmediatamente antes del inicio de la incubación (T0) y 24 h después (T24) de la incubación con el péptido en las mismas condiciones experimentales descritas en B y C. Las imágenes se obtuvieron en tapping y se muestran como datos de amplitud. Barra de escala = 1 µm, escala de colores: 0–150 mV.

Para investigar la capacidad del péptido para contrarrestar la toxicidad de tau in vivo, aprovechamos el uso de C. elegans como biosensor capaz de reconocer específicamente las formas tóxicas de tau. Se usaron homogeneizados de cerebro de ratones transgénicos P301L como fuente de tau tóxico mal plegado [26] y se administraron a gusanos solos o en presencia de una concentración creciente de Aβ1-6A2V(D) o Aβ1-6A2V-TAT(D). Este último péptido se utilizó ya que previamente habíamos demostrado que solo en presencia de la secuencia TAT, Aβ1-6A2V(D) puede atravesar la membrana del gusano, permitiendo sus efectos protectores contra la toxicidad de Aβ [18]. Como se muestra en la Fig. 2A-C, Aβ1-6A2V-TAT(D), pero no Aβ1-6A2V(D), protegió a los gusanos de la toxicidad causada por los homogeneizados de cerebro P301L. El efecto fue dependiente de la dosis, con un valor IC50 de 25,60 µM. Los péptidos solos, a una concentración de 50 µM, no causaron ningún efecto tóxico en C. elegans (Fig. 2C). También probamos la capacidad de Aβ1-6A2V-TAT(D) para contrarrestar la toxicidad de una forma anormal de tau generada en ratones WT 12 meses después de TBI. Como se mostró anteriormente, los homogeneizados de cerebro de ratones WT TBI, a diferencia de los de simulación, causaron un efecto tóxico en C. elegans, que se revirtió por completo con Aβ1-6A2V-TAT (D) 50 µM (Fig. 2D).

Se homogeneizaron cerebros de ratones P301L en PBS 10 mM, pH 7,4, y se administraron a gusanos solos o en presencia de Aβ1-6A2V-TAT(D). Los gusanos B se administraron con homogeneizado de cerebro (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL) en ausencia o presencia de Aβ1-6A2V-TAT(D) (0-200 µM). Los gusanos de control se trataron con PBS 10 mM, pH 7,4 (100 gusanos/100 µl) (línea de puntos). La actividad locomotora de los nematodos se calificó 7 días después del tratamiento. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos independientes (N = 30). C Se administraron homogeneizados de cerebro de ratones no transgénicos (Non-tg) y P301L a gusanos (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL). El homogeneizado de cerebro de P301L también se administró en presencia de Aβ1-6A2V(D) 50 µM, Aβ1-6A2V-TAT(D) 50 µM o péptido TAT 50 µM solo. Los gusanos de control se trataron con PBS 10 mM, pH 7,4 (vehículo), Aβ1-6A2V (D) 50 µM, Aβ1-6A2V-TAT (D) 50 µM o TAT 50 µM solo (100 gusanos/100 µL). La actividad locomotora de los nematodos se calificó 7 días después del tratamiento. °°°°p < 0,0001 y ****p < 0,0001 frente a vehículo, ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Bonferroni. Interacción P301L/ Aβ1-6A2V-TAT(D) = 0,001, ANOVA de dos vías y prueba post hoc de Bonferroni. D Tejidos pericontusionales de ratones WT Sham y TBI 12 meses después de la lesión (TBI) se homogeneizaron en PBS 10 mM, pH 7,4, y se administraron a gusanos (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL) en ausencia o presencia de 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D). Los gusanos de control se trataron con PBS 10 mM, pH 7,4 (100 gusanos/100 µl) (vehículo). La actividad locomotora de los nematodos se calificó 7 días después del tratamiento. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos independientes (N = 30). ****p < 0,0001 vs Vehicle- Aβ1-6A2V-TAT(D), §§§§p < 0,0001 vs Sham- Aβ1-6A2V-TAT(D), °p < 0,05, ANOVA unidireccional y post de Bonferroni prueba especial. Interacción TBI/ Aβ1-6A2V-TAT(D) = 0,05, ANOVA de dos vías y prueba post hoc de Bonferroni. Los lisados ​​E-G se prepararon a partir de homogeneizados de cerebro de ratones P301L. E, F El lisado cerebral de P301L (30 µg de proteína/100 µL) se incubó durante 2 h a 25 °C con Aβ1-6A2V-TAT(D) 50 µM (P301L + Aβ1-6A2V-TAT(D)) o PBS 10 mM , pH 7,4 (P301L). E Transferencia Western representativa que muestra el nivel total de tau y la cuantificación de tau expresada como el volumen medio de la banda de inmunorreactividad/actina de la banda DAKO. Los datos son la media ± SD (N = 3). *p < 0,05, prueba t de Student. F Transferencia Western representativa que muestra el ensayo de insolubilidad en detergente de fracciones solubles (S) e insolubles (I) analizadas con anticuerpo anti-tau DAKO o anticuerpo anti-actina. G Efecto de Aβ1-6A2V-TAT(D) sobre la proteólisis. Los homogeneizados de cerebro P301L (30 µg de proteína/100 µL) se incubaron durante 30 min a 37 °C con Aβ1-6A2V-TAT(D) 50 µM o el volumen equivalente de PBS 10 mM, pH 7,4, en presencia o ausencia de 2,5 µg/ml de proteinasa K (PK). A continuación, se detuvo la reacción y se analizaron las muestras mediante transferencia Western. Transferencia de Western representativa que muestra la proteólisis de tau sondada con anticuerpo anti-tau DAKO o anticuerpo anti-actina.

Luego se realizó un análisis bioquímico para dilucidar los mecanismos subyacentes a este efecto protector. La incubación del homogeneizado de cerebro P301L con Aβ1-6A2V-TAT(D) o Aβ1-6A2V(D), pero no con TAT solo, redujo significativamente el nivel de proteína tau (Fig. 2E y Fig. 1 complementaria) sin afectar la fracción de tau insoluble (Fig. 2F y Fig. 2 complementaria). En particular, el péptido aumentó la susceptibilidad de tau a la degradación por proteasas, y esto fue particularmente evidente en presencia de proteinasa K (Fig. 2G y Fig. 3 complementaria).

TBI acelera la deposición de tau en ratones propensos a AD, especialmente en ratones 3xTg-AD. Por lo tanto, elegimos evaluar el efecto protector de Aβ1-6A2V(D) en esta cepa usando ratones TBI jóvenes y aplicando un programa de tratamiento que ya demostró ser efectivo en un modelo de ratón con DA [16]. Llevamos a cabo un estudio de imágenes MALDI-TOF para evaluar si, como se observó en los ratones APPSwe/PS1dE9 [16], el péptido se distribuía de manera eficiente en el cerebro de los ratones TBI después de la administración intranasal. Los animales que recibieron vehículo (4 h post-TBI) se usaron como controles. Como se muestra en la Fig. 3, 4 horas y 24 horas después de la lesión, el péptido estaba presente en la corteza cerebral, el hipocampo, el caudado-putamen y el cerebelo. En particular, se detectaron niveles altos de Aβ1-6A2V(D) en los hemisferios ipsi y contralateral que persistieron, aunque en niveles bajos, hasta 48 h y no fueron detectables 72 h después de la administración (Fig. 3 y Fig. 4-5). Sobre la base de estas observaciones y los datos ya publicados [16], seleccionamos un programa de tratamiento que consiste en la administración intranasal de Aβ1-6A2V (D) a ratones cada 48 h. Por lo tanto, los ratones 3xTg-AD se expusieron a TBI y se trataron con 50 mg/kg pc de Aβ1-6A2V(D) o solución salina comenzando 10 min después de la lesión y luego cada 48 h hasta 7 días después de la TBI (Fig. 4A). TBI indujo un claro déficit de memoria espacial en el laberinto en Y a los 7 días posteriores a la lesión, y la administración de Aβ1-6A2V(D) atenuó significativamente el deterioro de la memoria, como lo demuestra el aumento del tiempo pasado en el nuevo brazo del laberinto. (Figura 4B).

A Los ratones se sometieron a TBI, se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos y se trataron por vía intranasal 10 minutos después de la lesión con una dosis única de Aβ1-6A2V(D) (50 mg/kg de peso corporal) o solución salina (vehículo). Los análisis de imágenes MALDI se realizaron 4 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la administración. B Imágenes representativas de la biodistribución de Aβ1-6A2V(D) evaluadas por MALDI-TOF y representadas como un mapa de calor (rojo > concentración de Aβ1-6A2V(D) > morado oscuro).

Una representación esquemática del diseño experimental, el paradigma de tratamiento Aβ1-6A2V(D) y las pruebas cognitivas. A los ratones 3xTg-AD TBI se les administró por vía intranasal Aβ1-6A2V(D) (50 mg/kg de peso corporal) o solución salina (vehículo) 10 min después de la lesión y luego cada 48 h a partir de entonces. (B) La función cognitiva de los ratones TBI tratados con Aβ1-6A2V(D) o vehículo se evaluó a los 7 días mediante la prueba del laberinto en Y de dos ensayos. Los datos son la media ± SEM *p < 0,5 (n = 7), prueba t de Student pareada. Los gusanos C se administraron con homogeneizado de cerebro de ratones Naive o 3xTg-AD TBI tratados con Aβ1-6A2V(D) (TBI Aβ1-6A2V(D)) o vehículo (vehículo TBI) (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL). D La actividad locomotora de los nematodos se calificó 7 días después del tratamiento. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos independientes (n = 20). ****p < 0,0001, ANOVA de una vía y prueba post hoc de Bonferroni. E Transferencias de Western representativas de Aβ en lisados ​​cerebrales de ratones 3xTg-AD TBI tratados con vehículo (vehículo TBI) o Aβ1-6A2V(D) (TBI Aβ1-6A2V(D)). Se cargaron cantidades iguales de proteínas en cada carril de gel y se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-Aβ (6E10) o anti-actina. La cuantificación de F Aβ se expresó como el volumen medio de la banda de inmunorreactividad/actina de la banda 6E10. Los datos son la media ± DE (n = 3). **p < 0,01, ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Bonferroni.

Anteriormente descubrimos que la proteína tau anormal que se acumula en los ratones TBI es responsable del deterioro de la función locomotora en C. elegans [26]. Ahora preguntamos si el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) en ratones 3xTg-AD TBI fue capaz de reducir la carga de tau y Aβ mitigando así la toxicidad del homogeneizado. Los gusanos se incubaron con homogeneizados de cerebro de ratones vírgenes y ratones tratados con vehículo TBI o Aβ1-6A2V(D). La frecuencia de flexión del cuerpo se puntuó después de 7 días. En comparación con los homogeneizados ingenuos, el vehículo TBI fue tóxico para C. elegans (p < 0,001, Fig. 4D) y el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) eliminó por completo esta toxicidad (p < 0,001 en comparación con el vehículo TBI). Este efecto protector no se asoció con cambios en la tau humana, los niveles de P-tau ni con la relación P-tau/tau en homogeneizados de cerebro, lo que posiblemente se explica por los niveles intrínsecamente altos de expresión de tau P301L en esta cepa transgénica (Fig. 6 complementaria) . En particular, los niveles de Aβ se redujeron significativamente en los cerebros de los ratones 3xTg-AD TBI que recibieron Aβ1-6A2V (D) (Fig. 4E, F), lo que confirma la reducción de la carga de amiloide en este grupo experimental. Este resultado puede explicarse parcialmente por la capacidad del péptido para inhibir de forma dependiente de la dosis la actividad de BACE in vitro, con un valor IC50 de 126 nM (Fig. 7A complementaria). Sin embargo, la falta de diferencias en la actividad BACE entre los homogeneizados de cerebro de ratones 3xTg-AD TBI tratados o no tratados con el péptido (Fig. 7B complementaria) sugiere que el programa de tratamiento aplicado puede inducir cambios a corto plazo in vivo que ya no eran observable 24 h después de la administración. No se puede excluir que otros mecanismos que conducen a la reducción de la cantidad de Aβ, como un efecto del péptido sobre su aclaramiento, puedan contribuir a la reducción de la carga de amiloide.

Al igual que los humanos, los ratones WT de envejecimiento normal muestran un aumento en la deposición de tau en el cerebro [43,44,45]. Además, las hembras, en comparación con los roedores machos, muestran un aumento de la patología tau en la red parietal-hipocampal, que se correlaciona positivamente con la disfunción neurológica [43, 44]. Dado que en los ancianos, las mujeres muestran una mayor incidencia de TCE debido a caídas en comparación con los hombres [46], la investigación de los efectos de Aβ1-6A2V(D) en ratones WT de edad femenina puede ser de gran relevancia clínica. Además, a diferencia de los humanos, los ratones WT de envejecimiento normal no desarrollan placas de Aβ, probablemente debido a las diferencias en la secuencia de Aβ entre roedores y humanos [47, 48]. Por lo tanto, los experimentos en ratones hembra WT TBI envejecidos nos permiten probar si la protección Aβ1-6A2V (D) se mantiene en ausencia de patología Aβ (Fig. 5A). Los ratones tratados con TBI Aβ1-6A2V(D) mostraron una mejora significativa en las deficiencias sensoriomotoras en comparación con el vehículo TBI hasta 7 días después de la lesión (p < 0,05, Fig. 5B). Para el día 7, el peso corporal disminuyó en los ratones tratados con vehículo TBI pero no en los ratones tratados con TBI Aβ1-6A2V(D), en comparación con los ratones simulados (Fig. 5C). De manera similar, la actividad locomotora también se redujo en los ratones con vehículo TBI (p <0.05, frente al simulado), mientras que no se detectó ninguna diferencia con el simulacro en los ratones tratados con TBI Aβ1-6A2V (D) (Fig. 8 complementaria). Los ratones TBI mostraron un claro déficit de memoria 7 días después de la lesión en el laberinto en Y. El tratamiento con Aβ1-6A2V(D) mejoró la función de la memoria a niveles comparables a los de los ratones simulados (TBI Aβ1-6A2V(D): p < 0,05, simulado: p < 0,05 brazo nuevo frente a familiar, Fig. 5D). Además, el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) redujo significativamente los niveles plasmáticos de NfL (p < 0,01 frente a TBI), lo que indica la capacidad del péptido para proteger contra el daño axonal causado por TBI [49]. El gráfico de radar de la figura 5F muestra el efecto global de Aβ1-6A2V(D) en los parámetros de resultado expresados ​​como puntuaciones z. El análisis bioquímico realizado en los homogeneizados de cerebro de estos ratones indicó que el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) redujo significativamente los niveles de P-tau y la relación P-tau/tau (Fig. 6A, C, D), pero no los niveles de tau total (Fig. 6B). La administración de homogeneizados de cerebro del vehículo TBI a C. elegans redujo significativamente la actividad locomotora de los gusanos después de 7 días. Este efecto tóxico no se observó en gusanos administrados con homogeneizados de ratones tratados con Aβ1-6A2V(D) (p < 0,001, Fig. 6E, F).

Un esquema del diseño experimental, el paradigma de tratamiento Aβ1-6A2V(D) y las pruebas cognitivas. A ratones TBI WT de edad avanzada (24 meses) se les administró por vía intranasal 50 mg/kg de peso corporal de Aβ1-6A2V(D) (TBI Aβ1-6A2V(D)) o solución salina (vehículo TBI) 10 minutos después de la lesión, y luego cada 48 h después de eso. B La función sensoriomotora se evaluó en ratones tratados con vehículo TBI y TBI Aβ1-6A2V(D) (n = 8–10) mediante pruebas SNAP 2 y 7 días después de la lesión. Los datos son la media ± SEM y RM-ANOVA de dos vías. Los efectos grupales significativos del tiempo, el tratamiento y la interacción se muestran en el recuadro. C El peso corporal se evaluó 7 días después de la lesión y se expresó como un porcentaje sobre el preoperatorio. Los datos son la media ± SEM (n = 8–10), **p < 0,01, ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de Tukey. D La función cognitiva se evaluó mediante la prueba del laberinto en Y de dos ensayos 7 días después de la LCT. Los datos son la media ± SEM, *p ≤ 0,5, ***p < 0,01, prueba t de Student pareada. Los niveles de E NfL en plasma se cuantificaron 7 días después de la lesión cerebral traumática. Las líneas punteadas representan la media ± SEM del simulacro. Los datos son la media ± SEM (N = 8–10), *p < 0,5, prueba t de Student no apareada. F Gráfico de radar que resume los efectos de TBI y el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) en múltiples parámetros, incluidas las funciones sensoriomotoras y cognitivas, el peso y los niveles de NfL como marcador indirecto de lesión axonal, expresado como puntuación z. Los resultados se representan como el valor medio.

Un Western blot representativo de tau total y fosforilada (P) y la relación P-tau/tau en lisados ​​de la corteza ipsilateral de ratones WT simulados y TBI envejecidos tratados con solución salina (vehículo TBI) o 50 mg/kg de peso corporal Aβ1-6A2V (D) (TBI Aβ1-6A2V(D)). Se cargaron cantidades iguales de proteínas en cada carril de gel y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-tau total (DAKO), anti-P-tau (198-199-202-205) o anti-actina. B, C Cuantificación de tau total y P-tau evaluada en lisados ​​cerebrales. Los datos están normalizados en los niveles de actina y son la media ± SD (N = 6 para tau y N = 10 para P.tau). **p < 0,01, ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Bonferroni. D P-tau/tau se calculó como la relación de la señal de inmunorreactividad de P-tau/actina a tau/actina total. Los datos son la media ± SD (N = 7) *p < 0,5, ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de Bonferroni. Los gusanos E se administraron con homogeneizado de cerebro de simulación, vehículo TBI o TBI Aβ1-6A2V(D) (30 µg de proteína/100 gusanos/100 µL). F La actividad locomotora de los nematodos se calificó 7 días después del tratamiento. Los datos son la media ± SEM de tres experimentos independientes (N = 80). ****p < 0,0001, ANOVA de una vía y prueba post hoc de Bonferroni.

Este estudio surge de la necesidad de conocer más a fondo el mecanismo de acción protector de Aβ1-6A2V(D) frente a la patología de EA que ha sido previamente demostrado en modelos in vitro e in vivo [16, 22]. Con la idea de que tau, que representa el otro actor clave relevante en el inicio y la progresión de la EA, además de Aβ, podría ser un objetivo farmacológico de la actividad peptídica, evaluamos los posibles efectos protectores de Aβ1-6A2V (D) contra la toxicidad de la proteína tau.

La LCT es un factor de riesgo ambiental importante para enfermedades neurodegenerativas como la EA [50,51,52,53,54]. Los tejidos cerebrales post mórtem de pacientes con antecedentes de TBI muestran múltiples proteinopatías y son comunes en las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad [55]. Aún debe abordarse por completo si interferir con las proteínas que se acumulan después de una LCT, incluidas tau y Aβ, puede conferir protección contra el desarrollo de demencia más adelante en la vida y atenuar la disfunción cognitiva.

En este estudio, primero mostramos el potencial multiobjetivo de Aβ1-6A2V(D) al confirmar que el péptido inhibía la agregación in vitro de tau incluso en su forma P301L mutada, conocida por ser más propensa a plegarse incorrectamente. Luego, empleando C. elegans como biosensor, investigamos el efecto de Aβ1-6A2V(D) sobre la proteotoxicidad de las isoformas de tau [26, 27]. Este enfoque produjo sinergias notables, lo que nos permitió tener una visión más profunda de la actividad de Aβ1-6A2V (D). En particular, el modelo de C. elegans proporcionó información detallada a nivel bioquímico, lo cual es difícil de lograr en animales vertebrados, especialmente en poco tiempo.

La observación más relevante de nuestros estudios bioquímicos fue que el efecto protector de Aβ1-6A2V(D) puede atribuirse a su capacidad no solo para impedir la agregación de tau sino también para favorecer su degradación por las proteasas tisulares. Esta última observación inesperada revela un nuevo mecanismo intrínseco explotado por el péptido que aún no se ha aclarado.

Por último, en el modelo TBI, probamos la relevancia del tratamiento agudo Aβ1-6A2V(D) para mejorar los resultados neurológicos en el contexto de la predisposición genética o relacionada con la edad a la EA. TBI por impacto cortical controlado conduce a la acumulación de tau hiperfosforilada dentro de las 24 h posteriores a la lesión en ratones transgénicos triples que expresan proteína tau humana y péptido Aβ humano [34, 56, 57]. Por lo tanto, primero elegimos ratones 3xTg-AD para investigar el efecto protector de Aβ1-6A2V (D) en TBI. Recientemente se ha demostrado que una sola administración intranasal del péptido se distribuye en el cerebro del ratón con AD [16]. Nuestros resultados confirman y amplían estos hallazgos al mostrar que después de una lesión cerebral traumática, Aβ1-6A2V(D) puede llegar de manera eficiente a áreas del cerebro cercanas al sitio de la contusión con altos niveles de péptido aún detectables 24 h después de la administración.

Encontramos que la administración de Aβ1-6A2V(D) 10 min después de la lesión y repetida tres veces cada 48 h previno la aparición de déficit de memoria, una característica patológica conocida tanto de 3xTg-AD [58, 59] como de TBI [60]. ratones. El análisis bioquímico de los homogeneizados de cerebro mostró una clara reducción de Aβ en ratones tratados con el péptido, como resultado de sus múltiples mecanismos, incluido el efecto inhibidor de BACE. Se afirmó un efecto similar en el procesamiento de la proteína precursora de amiloide (APP) en sujetos que portaban la sustitución protectora A673T en el gen APP [61]. Estos hallazgos sugieren que las sustituciones de A2X en la secuencia de Aβ pueden dar como resultado efectos beneficiosos para múltiples objetivos.

Aunque el tratamiento de ratones TBI 3xTg-AD con el péptido no resultó en un efecto significativo sobre los niveles de tau total o P-tau, fue capaz de reducir la toxicidad de los homogeneizados de cerebro después de la administración a los gusanos demostrando su capacidad para reducir la proteotoxicidad. formas tau. Esto puede depender de diferentes factores, el hecho de que a pesar de que estos ratones sobreexpresan niveles comparables de transgenes APP y tau, la patología Aβ surge primero y luego afecta el desarrollo de la neuropatología tau [34].

A continuación, probamos si en ratones WT envejecidos que mostraban un aumento del depósito de tau en el cerebro [62] y expuestos a TBI como un segundo golpe neurodegenerativo [28], el tratamiento con Aβ1-6A2V(D) también era eficaz para atenuar el deterioro cognitivo. Observamos que el hexapéptido atenuó los déficits sensoriomotores inducidos por TBI. Este resultado está en línea con los hallazgos de que los ratones tratados con vehículo, pero no los tratados con Aβ1-6A2V(D), mostraron una reducción en el peso corporal y la actividad locomotora, lo que sugiere un estado general más saludable de los ratones TBI envejecidos tratados con Aβ1-6A2V( D). Similar a lo que se observó en los ratones 3xTg-AD TBI, la administración de Aβ1-6A2V(D) evitó el deterioro agudo de la memoria espacial. De acuerdo con los efectos positivos del péptido sobre los resultados funcionales, los niveles plasmáticos de NfL, un marcador validado de lesión axonal que se sabe que se correlaciona con los resultados a largo plazo después de una LCT [49], se redujeron con el tratamiento. El efecto de Aβ1-6A2V(D) fue modesto en el resultado funcional, pero estuvo presente en múltiples parámetros de resultado, incluido el resultado cognitivo, la pérdida de peso y el daño axonal, lo que destaca su valor traslacional. Además, el análisis bioquímico de los homogeneizados de cerebro mostró una reducción de los niveles de P-tau y de la relación P-tau/tau [43, 44, 62].

En particular, en ratones WT envejecidos, no fue posible evaluar los niveles de Aβ ya que la APP humana y murina difieren en tres residuos de aminoácidos dentro de la secuencia del péptido Aβ [63]. Estas diferencias, así como los diferentes sitios de escisión de APP por BACE1 de ratón [63], disminuyen la propensión de los ratones viejos a desarrollar espontáneamente placas de Aβ.

Encontramos previamente que la patología tau es tóxica para C. elegans, con un defecto selectivo en la actividad locomotora inducida por la exposición a tejido TBI crónico pero no agudo de ratones jóvenes WT [26]. Aquí, mostramos que en el caso de la patología P-tau determinada genéticamente o relacionada con la edad, incluso el tejido cerebral TBI agudo es tóxico para C. elegans. En ratones 3xTg-AD, el plegamiento incorrecto de Aβ junto a P-tau también puede estar involucrado en la toxicidad observada. La administración de Aβ a C. elegans indujo solo un deterioro faríngeo, sin afectar la motilidad de los gusanos [18, 20]. En nematodos alimentados con tejidos TBI de ratones 3xTg-AD, no se detectó disfunción faríngea (datos no mostrados), lo que apunta al papel principal de tau en la toxicidad relacionada con TBI. Es importante destacar que nuestro enfoque de biosensor mostró que el tratamiento con Aβ1-6A2V (D) en ratones TBI 3xTg-AD y WT envejecidos eliminó por completo la toxicidad inducida por TBI en C. elegans. Por lo tanto, los datos destacan una acción multiobjetivo del tratamiento con Aβ1-6A2V(D) que posiblemente mitiga la toxicidad inducida por Aβ y tau después de una LCT.

Aunque el tratamiento de apoyo para el manejo de TBI ha progresado en los últimos 20 años, faltan estrategias neuroprotectoras específicas y existe una necesidad urgente de nuevas intervenciones terapéuticas. En general, nuestros datos muestran que Aβ1-6A2V(D) mejoró los resultados funcionales después de TBI y redujo la toxicidad de las proteinopatías provocadas por TBI. Es importante destacar que su eficacia en ratones TBI de edad avanzada podría resaltar su aplicación potencial en la población de edad avanzada. Este podría ser un hallazgo importante, ya que el número de pacientes mayores con TCE está aumentando, y la edad es un fuerte predictor de mortalidad y resultados desfavorables después de una TCE [64]. Se necesitan más estudios para investigar la eficacia de Aβ1-6A2V(D) en relación con la edad.

Nuestra tarea no puede considerarse completa porque Aβ1-6A2V(D) aún podría tener otros objetivos que impulsen su actividad protectora. Se están realizando estudios adicionales para revelar la posible participación de otros mecanismos subyacentes al efecto protector de Aβ1-6A2V(D) sobre el inicio y la progresión de la EA, así como de otras tauopatías.

Finalmente, podemos decir que Aβ1-6A2V(D) es un péptido multiobjetivo que lucha no solo contra la vía tóxica Aβ sino también contra la cascada tau, como se muestra en la Fig. 9 complementaria. Esta observación innovadora abre un mundo de posibilidades, una oportunidad de mejorar el arsenal farmacológico actual que solo aborda objetivos específicos de la patología de la EA.

Bloom GS. Amiloide-β y tau: el gatillo y la bala en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. JAMA Neurol. 2014;71:505–8.

Artículo PubMed Google Académico

Latimer CS, Stair JG, Hincks JC, Currey HN, Bird TD, Keene CD, et al. TDP-43 promueve la acumulación de tau y la neurotoxicidad selectiva en Caenorhabditis elegans bigénica. Dis Modelos Mecanismos. 2022;15:dmm049323.

Artículo CAS Google Académico

Larkin HD, Lecanemab, gana FDA. Aprobación para la enfermedad de Alzheimer temprana. JAMA. 2023;329:363.

Artículo PubMed Google Académico

Arndt JW, Qian F, Smith BA, Quan C, Kitchen KP, Bush MW, et al. Base estructural y cinética de la selectividad de aducanumab por formas agregadas de amiloide-β. representante científico 2018;8:6

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Salloway S, Chalkias S, Barkhof F, Burkett P, Barakos J, Purcell D, et al. Anomalías en la imagen relacionadas con amiloide en 2 estudios de fase 3 que evalúan aducanumab en pacientes con enfermedad de Alzheimer temprana. JAMA Neurol. 2022;79:13–21.

Artículo PubMed Google Académico

Catania M, Giaccone G, Salmona M, Tagliavini F, Di Fede G. Soñando con un mundo nuevo donde el Alzheimer sea un trastorno tratable. Neurociencia del envejecimiento frontal. 2019;11:317–24.

Sharma P, Srivastava P, Seth A, Tripathi PN, Banerjee AG, Shrivastava SK. Revisión exhaustiva de los mecanismos de patogenia implicados en la enfermedad de Alzheimer y posibles estrategias terapéuticas. Prog. Neurobiol. 2019; 174: 53–89.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mehta D, Jackson R, Paul G, Shi J, Sabbagh M. ¿Por qué siguen fallando los ensayos de medicamentos para la enfermedad de Alzheimer? Una perspectiva de drogas descontinuadas para 2010-2015. Experto Opin Investig Drugs. 2017;26:735–9.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cacabelos R. ¿Ha habido mejoras en el descubrimiento de fármacos para la enfermedad de Alzheimer en los últimos 5 años? Opinión de expertos Descubrimiento de drogas. 2018;13:523–38.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cummings JL, Morstorf T, Zhong K. Tubería de desarrollo de fármacos para la enfermedad de Alzheimer: pocos candidatos, fracasos frecuentes. Alzheimer Res Ther. 2014;6:37.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hardy J, Selkoe DJ. La hipótesis amiloide de la enfermedad de Alzheimer: avances y problemas en el camino hacia la terapéutica. Ciencia. 2002;297:353–6.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Imbimbo BP, Ippati S, Watling M, Balducci C. Una evaluación crítica de las terapias dirigidas a tau para tauopatías primarias y secundarias. Demencia de Alzheimer. 2022;18:1008–37.

Artículo CAS Google Académico

Jadhav S, Avila J, Schöll M, Kovacs GG, Kövari E, Skrabana R, et al. Un paseo por las estrategias terapéuticas de tau. Acta Neuropathologica Commun. 2019;7:22.

Artículo Google Académico

Di Fede G, Catania M, Morbin M, Rossi G, Suardi S, Mazzoleni G, et al. Una mutación recesiva en el gen APP con efecto dominante negativo sobre la amiloidogénesis. Ciencia. 2009;323:1473–7.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Cantu' L, Colombo L, Stoilova T, Demé B, Inouye H, Booth R, et al. La mutación A2V como una nueva herramienta para obstaculizar la agregación de Aβ: un estudio de difracción de rayos X y neutrones. Sci Rep. 2017;7:5510.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Catania M, Colombo L, Sorrentino S, Cagnotto A, Lucchetti J, Barbagallo MC, et al. Una nueva estrategia bioinspirada para prevenir la amiloidogénesis y el daño sináptico en la enfermedad de Alzheimer. Mol Psiquiatría. 2022. https://doi.org/10.1038/s41380-022-01745-x.

Di Fede G, Catania M, Morbin M, Giaccone G, Moro ML, Ghidoni R, et al. Gen bueno, gen malo: la nueva variante de APP puede ser ambas cosas. Prog. Neurobiol. 2012;99:281–92.

Artículo PubMed Google Académico

Diomede L, Romeo M, Cagnotto A, Rossi A, Beeg M, Stravalaci M, et al. El nuevo péptido derivado de β amiloide Aβ1-6A2V-TAT(D) previene la formación de oligómeros de Aβ y protege a la C. elegans transgénica de la toxicidad de Aβ. Neurobiol Dis. 2016;88:75–84.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Messa M, Colombo L, del Favero E, Cantù L, Stoilova T, Cagnotto A, et al. El papel peculiar de la mutación A2V en el ensamblaje molecular amiloide-β (Aβ) 1-42. J Biol Chem. 2014;289:24143–52.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diomede L, Di Fede G, Romeo M, Bagnati R, Ghidoni R, Fiordaliso F, et al. La expresión de Aβ mutado en A2V en Caenorhabditis elegans da como resultado la formación de oligómeros y toxicidad. Neurobiol Dis. 2014;62:521–32.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cimini S, Sclip A, Mancini S, Colombo L, Messa M, Cagnotto A, et al. El péptido Aβ1-6A2VTAT(D) permeable a las células revierte la sinaptopatía inducida por Aβ1-42wt. Neurobiol Dis. 2016;89:101–11.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Di Fede G, Catania M, Maderna E, Morbin M, Moda F, Colombo L, et al. Abordar la amiloidogénesis en la enfermedad de Alzheimer con variantes A2V de amiloide-β. representante científico 2016;6:20949.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Maloney JA, Bainbridge T, Gustafson A, Zhang S, Kyauk R, Steiner P, et al. Mecanismos moleculares de protección contra la enfermedad de Alzheimer por el alelo A673T de la proteína precursora de amiloide. J Biol Chem. 2014;289:30990–31000.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Benilova I, Gallardo R, Ungureanu AA, Castillo Cano V, Snellinx A, Ramakers M, et al. La mutación protectora de la enfermedad de Alzheimer A2T modula las propiedades cinéticas y termodinámicas de la agregación de amiloide-β (Aβ). J Biol Chem. 2014;289:30977–89.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Natale C, Barzago MM, Diomede L. Caenorhabditis elegans Modelos para investigar los mecanismos subyacentes a la toxicidad de Tau en las tauopatías. Ciencia del cerebro. 2020;10:E838.

Artículo Google Académico

Zanier ER, Barzago MM, Vegliante G, Romeo M, Restelli E, Bertani I, et al. C. elegans detecta la toxicidad de la tau generada por una lesión cerebral traumática. Neurobiol Dis. 2021;153:105330.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Natale C, Barzago MM, Colnaghi L, De Luigi A, Orsini F, Fioriti L, et al. Un enfoque combinado de células y gusanos para buscar compuestos que contrarresten la toxicidad de los oligómeros de tau in vivo. Int J Mol Sci. 2022;23:11277.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zanier ER, Bertani I, Sammali E, Pischiutta F, Chiaravalloti MA, Vegliante G, et al. Inducción de una patología tau transmisible por lesión cerebral traumática. Cerebro. 2018;141:2685–99.

PubMed PubMed Central Google Académico

Risling M, Smith D, Stein TD, Thelin EP, Zanier ER, Ankarcrona M, et al. Modelado de la patología humana de la lesión cerebral traumática en modelos animales. J Intern Med. 2019;285:594–607.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt ML, Zhukareva V, Newell KL, Lee VM, Trojanowski JQ. El perfil de isoforma tau y el estado de fosforilación en la demencia pugilística recapitulan la enfermedad de Alzheimer. Acta Neuropathol. 2001; 101:518–24.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Agrawal S, Leurgans SE, James BD, Barnes LL, Mehta RI, Dams-O'Connor K, et al. Asociación de lesión cerebral traumática con y sin pérdida de conciencia con resultados neuropatológicos en personas mayores que viven en la comunidad. Abierto de la Red JAMA. 2022;5:e229311.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Shively S, Scher AI, Perl DP, Diaz-Arrastia R. Dementia resultante de una lesión cerebral traumática: ¿cuál es la patología? Arco Neurol. 2012;69:1245–51.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Li Y, Li Y, Li X, Zhang S, Zhao J, Zhu X, et al. Lesión en la cabeza como factor de riesgo para la demencia y la enfermedad de Alzheimer: una revisión sistemática y metanálisis de 32 estudios observacionales. Más uno. 2017;12:e0169650.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Oddo S, Caccamo A, Shepherd JD, Murphy MP, Golde TE, Kayed R, et al. Modelo transgénico triple de la enfermedad de Alzheimer con placas y ovillos: Abeta intracelular y disfunción sináptica. Neurona. 2003;39:409–21.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kilkenny C, Browne WJ, Cuthill IC, Emerson M, Altman DG. Mejorar los informes de investigación en biociencias: las pautas ARRIVE para informar sobre investigaciones con animales. Farmacéutico J Pharm. 2010;1:94–99.

Artículo Google Académico

Moro F, Fossi F, Magliocca A, Pascente R, Sammali E, Baldini F, et al. Eficacia de la administración aguda de argón inhalado en lesiones cerebrales traumáticas en ratones. Hermano J Anaesth. 2021;126:256–64.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moro F, Pischiutta F, Portet A, Needham EJ, Norton EJ, Ferdinand JR, et al. El envejecimiento se asocia con una respuesta inmunitaria desadaptativa y un peor resultado después de una lesión cerebral traumática. Cerebro Comun. 2022;4:fcac036.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Brody DL, Mac Donald C, Kessens CC, Yuede C, Parsadanian M, Spinner M, et al. Dispositivo de impacto cortical controlado electromagnéticamente para lesiones cerebrales traumáticas experimentales precisas y graduadas. J Neurotrauma. 2007;24:657–73.

Artículo PubMed Google Académico

Hanson LR, Fine JM, Svitak AL, Faltesek KA. Administración intranasal de terapias del SNC a ratones despiertos. J Vis Exp. 2013. Abril. https://doi.org/10.3791/4440.

Porta-de-la-Riva M, Fontrodona L, Villanueva A, Cerón J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J Vis Exp. 2012;4019–27.

Goedert M, Jakes R, Spillantini MG, Hasegawa M, Smith MJ, Crowther RA. Ensamblaje de proteína tau asociada a microtúbulos en filamentos tipo Alzheimer inducidos por glicosaminoglicanos sulfatados. Naturaleza. 1996;383:550–3.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang W, Falcon B, Murzin AG, Fan J, Crowther RA, Goedert M, et al. Los filamentos de tau inducidos por heparina son polimórficos y difieren de los de las enfermedades de Alzheimer y Pick. ELife. 2019;8:e43584.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Stimmell AC, Xu Z, Moseley SC, Cushing SD, Fernandez DM, Dang JV, et al. El perfil patológico de Tau a través de una red cerebral parietal-hipocampal está asociado con el aprendizaje de reorientación espacial y el rendimiento de la memoria en el ratón 3xTg-AD. Envejecimiento Frontal. 2021;2:655015–37.

Javonillo DI, Tran KM, Phan J, Hingco E, Kramár EA, da Cunha C, et al. Fenotipado sistemático y caracterización del modelo de ratón 3xTg-AD de la enfermedad de Alzheimer. Neurociencia frontal. 2022;15:785276–92.

Lau V, Ramer L, Tremblay M-È. Una hipótesis de envejecimiento, carga patológica y acumulación de senescencia glial para la enfermedad de Alzheimer de aparición tardía. Nat Comun. 2023;14:1670.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maas AIR, Menon DK, Manley GT, Abrams M, Åkerlund C, Andelic N, et al. Traumatismo craneoencefálico: avances y desafíos en prevención, atención clínica e investigación. Lancet Neurol. 2022;21:1004–60.

Artículo PubMed Google Académico

Kitazawa M, Medeiros R, La Ferla FM. Modelos de ratones transgénicos de la enfermedad de Alzheimer: desarrollo de un mejor modelo como herramienta para intervenciones terapéuticas. Curr Pharm Des. 2012;18:1131–47.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dyrks T, Dyrks E, Masters CL, Beyreuther K. Amiloidogenicidad de secuencias beta A4 de roedores y humanos. FEBS Lett. 1993;324:231–6.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Graham NSN, Zimmerman KA, Moro F, Heslegrave A, Maillard SA, Bernini A, et al. La luz de neurofilamento marcador axonal predice los resultados a largo plazo y la neurodegeneración progresiva después de una lesión cerebral traumática. Sci Transl Med. 2021;13:eabg9922.

Perry DC, Sturm VE, Peterson MJ, Pieper CF, Bullock T, Boeve BF, et al. Asociación de lesión cerebral traumática con enfermedad neurológica y psiquiátrica posterior: un metanálisis. J Neurocirugía. 2016;124:511–26.

Artículo PubMed Google Académico

Gardner RC, Burke JF, Nettiksimmons J, Kaup A, Barnes DE, Yaffe K. Riesgo de demencia después de una lesión cerebral traumática frente a un traumatismo no cerebral: el papel de la edad y la gravedad. JAMA Neurol. 2014;71:1490–7.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Nordström P, Michaëlsson K, Gustafson Y, Nordström A. Lesión cerebral traumática y demencia de aparición temprana: un estudio de cohorte a nivel nacional. Ana Neurol. 2014;75:374–81.

Artículo PubMed Google Académico

Guo Z, Cupples LA, Kurz A, Auerbach SH, Volicer L, Chui H, et al. Lesión en la cabeza y el riesgo de AD en el estudio MIRAGE. Neurología. 2000;54:1316–23.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mortimer JA, van Duijn CM, Chandra V, Fratiglioni L, Graves AB, Heyman A, et al. El traumatismo craneoencefálico como factor de riesgo de la enfermedad de Alzheimer: un nuevo análisis colaborativo de estudios de casos y controles. Grupo de Investigación de Factores de Riesgo EURODEM. Int J Epidemiol 1991;20:S28–35.

Artículo PubMed Google Académico

Uryu K, Chen XH, Martinez D, Browne KD, Johnson VE, Graham DI, et al. Múltiples proteínas implicadas en enfermedades neurodegenerativas se acumulan en los axones después de un traumatismo cerebral en humanos. Exp. Neurol. 2007;208:185–92.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tran HT, LaFerla FM, Holtzman DM, Brody DL. La lesión cerebral traumática de impacto cortical controlado en ratones 3xTg-AD provoca una acumulación aguda de amiloide-β intraaxonal y acelera de forma independiente el desarrollo de anomalías de Tau. J Neurosci. 2011;31:9513–25.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shitaka Y, Tran HT, Bennett RE, Sanchez L, Levy MA, Dikranian K, et al. La lesión cerebral traumática repetitiva de cráneo cerrado en ratones causa lesión axonal multifocal persistente y reactividad microglial. J Neuropathol Exp Neurol. 2011;70:551–67.

Artículo PubMed Google Académico

Stover KR, Campbell MA, Van Winssen CM, Brown RE. Detección temprana de déficits cognitivos en el modelo de ratón 3xTg-AD de la enfermedad de Alzheimer. Comportamiento Cerebro Res. 2015;289:29–38.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stevens LM, Brown RE. Déficits de memoria de referencia y de trabajo en el ratón 3xTg-AD entre 2 y 15 meses de edad: un estudio transversal. Res. cerebral conductual. 2015;278:496–505.

Artículo Google Académico

Fox GB, Fan L, Levasseur RA, Faden AI. Déficits sensoriales/motores y cognitivos sostenidos con apoptosis neuronal después de una lesión cerebral por impacto cortical controlado en ratones. J Neurotrauma. 1998; 15:599–614.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jonsson T, Atwal JK, Steinberg S, Snaedal J, Jonsson PV, Bjornsson S, et al. Una mutación en APP protege contra la enfermedad de Alzheimer y el deterioro cognitivo relacionado con la edad. Naturaleza. 2012;488:96–99.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Torres AK, Jara C, Olesen MA, Tapia-Rojas C. La tau patológicamente fosforilada en S396/404 (PHF-1) se acumula dentro de las mitocondrias sinápticas del hipocampo de ratones de tipo salvaje envejecidos. Sci Rep. 2021;11:4448.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu G, Ran Y, Fromholt SE, Fu C, Yachnis AT, Golde TE, et al. La sobreproducción de Aβ murino produce depósitos de amiloide de tipo Alzheimer difusos y compactos. Acta Neuropathol Commun. 2015;3:72.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Gardner RC, Dams-O'Connor K, Morrissey MR, Manley GT. Lesión cerebral traumática geriátrica: epidemiología, resultados, brechas de conocimiento y direcciones futuras. J Neurotrauma. 2018;35:889–906.

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

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Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Actual del Ministerio de Salud italiano (RC) para GDF y MC, Ministerio de Salud - 5×1000/2017 para GDF, Fondazione Sacchetti 2022-2023 para MS y LD, FONDAZIONE REGIONALE PER LA RICERCA BIOMEDICA (Care4NeuroRare CP_20/2018) a LD. C. elegans y OP50 E. coli fueron proporcionados por el GCG, que está financiado por los programas de infraestructura de investigación de la oficina de los NIH (P40 OD010440).

Estos autores contribuyeron por igual: Luisa Diomede, Elisa R. Zanier.

Departamento de Bioquímica Molecular y Farmacología, Instituto Mario Negri de Investigación Farmacológica IRCCS, Via Mario Negri 2, Milán, Italia

Luisa Diomede, Laura Colombo, Luca Russo, Alfredo Cagnotto, Carmina Natale, Federica Marta Xodo, Ada De Luigi, Michele Mosconi, Marten Beeg & Mario Salmona

Departamento de Neurociencia, Instituto Mario Negri de Investigación Farmacológica IRCCS, Via Mario Negri 2, Milán, Italia

Elisa R. Zanier, Federico Moro & Gloria Vegliante

Neurología V – Unidad de Neuropatología, Fundación IRCCS Instituto Neurológico Carlo Besta, Via Celoria 11, Milán, Italia

Marcella Catania, Giacomina Rossi, Fabrizio Tagliavini y Giuseppe Di Fede

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MS, LD y ERZ concibieron la idea presentada. FM, GV, LC, LR, AC, CN, FMX, ADL, MM, MB, MC y GR realizaron los experimentos. MS, LD y ERZ supervisaron el proyecto. FT y GDF ayudaron a supervisar el proyecto. MS, LD y ERZ escribieron el manuscrito con el apoyo de FM y CN. Todos los autores discutieron los resultados y contribuyeron al manuscrito final.

Correspondencia a Luisa Diomede oa Mario Salmona.

GDF y FT tienen dos patentes (EP2220251A2 y WO2021001405) relacionadas con este trabajo. MS tiene una patente (WO2021/001405) relacionada con este trabajo.

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Reimpresiones y permisos

Diomede, L., Zanier, ER, Moro, F. et al. El péptido Aβ1-6A2V(D), eficaz en la agregación de Aβ, inhibe el plegamiento incorrecto de tau y protege el cerebro después de una lesión cerebral traumática. Mol Psiquiatría (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02101-3

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Recibido: 10 enero 2023

Revisado: 21 de abril de 2023

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 17 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02101-3

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