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Aug 04, 2023

Una nueva nanopartícula de PLGA teranóstico sensible al pH para la terapia de captura de neutrones de boro en el tratamiento del mesotelioma

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 620 (2023) Citar este artículo

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Este estudio tiene como objetivo desarrollar nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) con un enfoque innovador guiado por imágenes basado en la terapia de captura de neutrones de boro para el tratamiento del mesotelioma. Los resultados informados en este documento demuestran que las nanopartículas de PLGA que incorporan cadenas de oligohistidina y el agente teranóstico dual Gd/B AT101 pueden explotarse con éxito para administrar una dosis terapéutica de boro a las células de mesotelioma, significativamente más alta que en las células mesoteliales sanas según lo evaluado por ICP- EM y resonancia magnética. La liberación selectiva responde al pH aprovechando el pH ligeramente ácido del entorno extracelular del tumor y desencadenada por la protonación de los grupos imidazol de la histidina. Después de la irradiación con neutrones térmicos, se evaluó la supervivencia y la capacidad clonogénica de las células tumorales y sanas. Los resultados obtenidos parecen muy prometedores, proporcionando a los pacientes afectados por esta rara enfermedad una opción terapéutica mejorada, aprovechando las nanopartículas de PLGA.

El mesotelioma maligno (MM) es un tumor agresivo con mal pronóstico cuya incidencia y mortalidad están en función de la exposición previa al amianto, incluso después de un período de latencia de 30 a 50 años. El MM se reconoce como una enfermedad ocupacional rara que carece de una terapia eficaz, y la mediana de supervivencia después del diagnóstico es de menos de 9 a 12 meses1,2. El MM es un tumor diseminado que se extiende por toda la pleura o el peritoneo. Las radioterapias convencionales tienen una eficacia limitada debido a varios tejidos radiosensibles, que limitan la dosis máxima administrable a los nódulos malignos. Hoy en día, las terapias dirigidas representan uno de los principales enfoques de la investigación del cáncer, y se espera que muchos avances futuros en el tratamiento del cáncer provengan de este enfoque. Sin embargo, todavía no existe una terapia eficaz basada en el direccionamiento molecular contra el MM. Básicamente, sigue siendo un desafío para los médicos realizar un diagnóstico temprano de MM debido a la falta de conocimiento de los biomarcadores precisos de MM. A pesar de los numerosos estudios destinados a encontrar biomarcadores adecuados en sangre y derrames pleurales, estos esfuerzos aún no han producido una herramienta diagnóstica eficaz3,4. Por tanto, la opción de tratamiento estándar sigue siendo una biopsia invasiva seguida de una quimioterapia con cisplatino y pemetrexed, con o sin bevacizumab5, con muchos efectos secundarios y baja eficacia. En este contexto, las nanopartículas poliméricas pueden ser una buena opción para la administración de fármacos y agentes de formación de imágenes a las células cancerosas del mesotelioma, mejorando la eficacia terapéutica y diagnóstica y disminuyendo la toxicidad fuera del objetivo6. Las nanopartículas pueden liberar fármacos específicamente en el sitio del tumor debido a la permeabilidad local mejorada y al efecto de retención. Entre los diferentes polímeros biodegradables, que recientemente han recibido gran atención, las nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA-NP) se han propuesto como agentes de liberación para el tratamiento del cáncer7,8,9,10. Entre los sistemas de administración de fármacos aprobados por la FDA de EE. UU., los PLGA son algunos de los polímeros biodegradables más efectivos, debido a sus propiedades de liberación controlada y sostenida, baja toxicidad y biocompatibilidad con tejidos y células. En este documento, cargamos los PLGA-NP con un compuesto de diagnóstico de terapia dual que lleva un agente de contraste de imágenes por resonancia magnética (MRI) basado en Gd y un resto de carborano (grupos lipofílicos icosaédricos que contienen átomos de boro) utilizados para la terapia de captura de neutrones (NCT) . La NCT es un ejemplo de terapia dirigida con buena eficacia y baja toxicidad que proporciona una muerte celular selectiva del tumor11,12,13. Más específicamente, esta terapia puede combinar la irradiación de neutrones térmicos de baja energía con la presencia de agentes que contienen boro en los tejidos patológicos objetivo. Los neutrones son capturados por 10B no radiactivo, lo que desencadena una reacción nuclear en descomposición que libera partículas alfa y 7Li, lo que provoca un gran daño biológico en aproximadamente 10 µm de diámetro, que es menor que el diámetro promedio de una célula de mamífero. Por lo tanto, al administrar boro y producir radiación alfa de forma selectiva en las células enfermas, la NCT puede matar las patológicas sin afectar los tejidos sanos circundantes. Estas características hacen de la BNCT un tratamiento prometedor para metástasis difusas y tumores infiltrantes como el mesotelioma, que no pueden ser tratados o son resistentes a métodos habitualmente aplicables en una masa tumoral localizada, como la radioterapia convencional o la cirugía14. BNCT se ha aplicado a melanoma de piel, tumores cerebrales, de cabeza y cuello, y se ha recopilado una gran cantidad de datos clínicos a través de los diferentes ensayos clínicos (fase I/II) llevados a cabo en Japón, EE. UU., Países Bajos, Suecia, Finlandia, Argentina. y Taiwán15,16. Nakamura y sus colaboradores desarrollaron recientemente un ácido hialurónico que contiene mercaptoundecahidro-closo-dodecaborato de sodio (BSH) administrado específicamente a MM en modelos preclínicos de ratones17. Además, en 2006, un pequeño número de pacientes con MM fueron tratados de forma segura con BNCT en Japón, logrando una paliación significativa de los síntomas18. Sin embargo, para lograr la eficacia de la BNCT, los portadores de boro deben respetar diferentes condiciones: (i) baja toxicidad sistémica; (ii) alta selectividad por células tumorales; (iii) larga vida media dentro del tumor durante la duración del tratamiento. Se ha estimado que se necesitan aproximadamente 10-30 μg de B por gramo de masa tumoral para lograr un tratamiento eficaz, utilizando un tiempo de irradiación tolerable y una fuente de neutrones adecuada19. Los dos compuestos que se utilizan actualmente en ensayos clínicos son p-borono-l-fenilalanina (BPA) (utilizado en ensayos para glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello y melanoma) y BSH (diseñado para tratamientos de tumores cerebrales). Estos agentes producen una proporción de concentración de boro en el tumor y el tejido normal entre 3 y 6, lo que permite un tratamiento seguro y bastante eficaz. Sin embargo, es una opinión generalizada en la comunidad científica que será posible una aplicación clínica más amplia de BNCT cuando se mejore aún más la captación de células tumorales dirigidas19. Como ejemplo de una estrategia de orientación exitosa, nuestro grupo ha propuesto las lipoproteínas de baja densidad (LDL) cargadas con AT101 como un transportador de lípidos endógenos para la administración específica de boro a diferentes tipos de tumores como el melanoma20, metástasis de mama pulmonar21 y recientemente mesotelioma22. AT101 (Esquema 1) es un agente dual que contiene un resto carborano funcionalizado con un agente de contraste basado en Gd. Entre los derivados del boro, los carboranos ocupan un lugar especial tanto por su alto contenido en boro (10 átomos de B) como por su versatilidad química unida a una alta estabilidad in vivo23,24,25,26.

Representación esquemática de nanopartículas PLGA-His.

En este estudio, se desarrollaron nanopartículas de PLGA funcionalizadas con una secuencia de aminoácidos única que consta de 15 residuos de histidina (His) (CGGH15βA), a saber, PLGA-His, para la liberación controlada del agente que contiene B en la proximidad del microambiente tumoral con un mecanismo desencadenado por el pH. De hecho, el pKa de la histidina en su forma oligomérica es de aproximadamente 6,827, por lo que estando por debajo de pH 7 el anillo de imidazol está protonado. Esto ocurre también cuando el oligo-His se conjuga con una cadena polimérica de PLGA formando una nanopartícula estable28. Esto se demostró gracias a la presencia de átomos 14N de histidina que provocan un aumento de la relajación cuadrupolar (también llamado pico cuadrupolar, QP) a 1,39 MHz, bien detectable mediante un relaxómetro de RMN de ciclo rápido de campo28. La mejora de la relajación depende del pH en el rango de 6,5 a 7,5, por lo que actúa como indicador de la integridad de la nanopartícula o del andamio28,29. Como se ha demostrado que en el microambiente del cáncer el pH está alterado y es más ácido que el fisiológico30, aquí se propone el uso de estas nanopartículas sensibles al pH que contienen B y Gd que interactúan selectivamente con las membranas celulares para liberar el fármaco encapsulado en la proximidad de los tejidos tumorales. El uso de materiales híbridos de polímeros conjugados con polihistidina para la administración de doxorrubicina sensible al pH ya se informa en la literatura31,32. Además, en este estudio, se utilizó la administración selectiva activada por pH de B y Gd que contenían NP teranósticos para un tratamiento selectivo de mesotelioma con BNCT. La presencia de reporteros MRI basados ​​​​en Gd33 permite la determinación cuantitativa indirecta de boro en el sitio objetivo antes y durante la irradiación de neutrones33,34,35,36. Este enfoque puede abrir nuevas estrategias terapéuticas para los pacientes afectados por MM, lo que conducirá a mejores resultados del tratamiento en términos de tiempo de supervivencia y calidad de vida.

PLGA Resomer® RG 502 H, Mowiol 4–88 (poli(vinil alcohol), Mw ~ 31 000), DSPE-PEG(2000)metoxi(1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N[metoxi(polietileno glicol)-2000] y todos los demás productos químicos y disolventes se adquirieron de Merk Life Science Srl (Milán, Italia).

Oligo-His-PLGA se preparó de acuerdo con el procedimiento previamente informado28. Brevemente, la secuencia peptídica CGGH15βA se ensambló mediante síntesis peptídica en fase sólida automatizada y luego se conjugó con PLGA-PEG2-Mal, preparado internamente a partir de PLGA Resomer® RG 502 H y maleimida-PEG2-NH2. Se preparó AT101 enriquecido con 10B (ligando enriquecido con 10B-C-[N-(DOTAMA-C6)-carbamoilmetil]C′-palmitamidometil-o-carborano) de acuerdo con el procedimiento informado anteriormente37.

Las PLGA NP se obtuvieron siguiendo el método de emulsión o/w38. La fase orgánica se preparó disolviendo 12,5 mg de PLGA Resomer® RG 502 H, 12,5 mg de Oligo-His-PLGA, 2,2 mg de DSPE-PEG(2000)metoxi y 3 mg de AT101 disueltos en 0,5 ml de 3:1 ( v/v) cloroformo-metanol. El PLGA-CTRL se realizó siguiendo el mismo procedimiento disolviendo 25 mg de PLGA RG 502H, sin ninguna parte del resómero conjugado con -oligo-histidina. La fase acuosa consistió en 3 ml de una solución acuosa de Mowiol 4–88 al 3 % (p/v). La solución de PLGA orgánico se mezcló gota a gota con la solución de PVA y se sonicó inmediatamente a 4 °C, 4 veces, durante 1 min, con una potencia de sonicación del 100 %. La fase orgánica se eliminó mediante evaporación rotatoria en un matraz redondo de vidrio de 500 ml durante 2 h. Después de la evaporación, el fármaco no atrapado se eliminó mediante diálisis (límite de peso molecular de 14.000 Da) a 4 °C en 2 L de tampón isotónico NaCl/Hepes (HBS). El exceso de PVA se eliminó lavando la solución de NP con un filtro vivaspin 20 (Sartorius AG, Goettingen, Alemania, corte de 1 × 106 Da) y al final del paso de lavado, se tomó un volumen final de 3 ml. alcanzado para todas las suspensiones de nanopartículas consideradas. La cantidad de Gd y B incorporada en las nanopartículas de PLGA se midió mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS; elemento-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italia) después de la digestión de la muestra realizada con HNO3 concentrado (70 %, 0,4 ml) mediante calentamiento a 150 °C durante 8′ bajo sistema de digestión por microondas (ETHOS UP Milestone, Bérgamo, Italia). La cantidad de Gd se verificó dos veces mediante medición R1 de resonancia magnética nuclear 1H a 21,5 MHz, 25 °C (Stelar Spinmaster, Mede, Italia) de la solución de complejo mineralizado (en HCl 6 M a 120 °C durante 16 h). El diámetro medio hidratado y el potencial z de las nanopartículas se determinaron utilizando un medidor Malvern Zeta 3000HS de dispersión de luz dinámica (DLS). (Malvern, Reino Unido) Las nanopartículas se almacenaron en la oscuridad a 4 °C hasta su posterior análisis.

La estabilidad de las NP PLGA-CTRL y PLGA-His se realizó incubando ambas NP en 40 mL de tampón NaCl/Hepes a pH 6,0 o 7,4 a 37 °C bajo diálisis en membranas de 14 KDa y sus tasas de relajación longitudinal (R1 obs ) se midieron después de 3, 6, 24, 48 y 72 h a 21,5 MHz y 25 °C.

El mesotelioma murino AB22 y las líneas de células mesoteliales sanas humanas MeT-5A se adquirieron de Sigma y ATCC, respectivamente. Las células AB22 se cultivaron en medio RPMI suplementado con Hepes 25 mM, FBS al 10 %, P/S al 1 % y Glutamina 2 mM, mientras que MeT-5A se cultivó en Medio 199 suplementado con FBS al 10 %, P/S al 1 %, 8,7 E-4 mM de insulina bovina, 3.3E-6 mM de EGF humano, 4E-4 mM de hidrocortisona y Trace Elements B (Corning) y mantenido en una incubadora con CO2 al 5% a 37 °C.

Se sembraron 5 × 105 células AB22 y MeT-5A en placas de Petri de 6 cm de diámetro y se mantuvieron hasta alcanzar el 80% de confluencia. Posteriormente, se incubaron concentraciones crecientes de nanopartículas PLGA-CTRL y PLGA-His que contenían Gd durante 24 ha 37 °C. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y se separaron con una solución de Tripsin/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Luego, los sedimentos celulares se resuspendieron en 0,2 ml de PBS, se sonicaron (30 % de potencia, 30 s) en hielo y se mineralizaron de acuerdo con el procedimiento informado anteriormente. Las proteínas celulares de cada muestra se cuantificaron utilizando el ensayo Bradford comercial (Biorad). Los nmoles de Gd y B internalizados por cada muestra celular, medidos por ICP-MS, se normalizaron al número total de células. El número de células se obtuvo a partir de los mg de proteínas celulares medidos por el ensayo de Bradford, utilizando la curva de calibración: [(mg de proteína)/(número de células)]. De esta calibración 1 millón de AB22 y MeT-5A corresponden a 0,606 y 0,435 mg de proteínas, respectivamente. A partir de los datos de ICP-MS, fue posible calcular las ppm de boro suponiendo una densidad de aprox. 108 células por cm3 en el caso de tumores epiteliales (con un diámetro entre 15-20 µm)38.

Imágenes potenciadas en T1: capilares de vidrio que contenían sedimentos de células de NP no tratadas o tratadas con (0,0974 mM [Gd]) AB22 y MeT-5A se colocaron en un fantoma de agar y se adquirieron mediante resonancia magnética utilizando un espectrómetro Bruker Avance Neo de 300 MHz (7 T) equipado con una sonda de microimagen Micro 2.5 (BrukerBioSpin, Ettlingen, Alemania). Las imágenes T1W se obtuvieron utilizando una secuencia estándar MSME (Multi-Slice Multi-Echo) con los siguientes parámetros: TR = 250 ms, TE = 3 ms, FOV = 12 × 12 mm, espesor de corte = 1 mm, NEX = 6, matriz tamaño 128 × 128.

Los matraces T25 de AB22 y MeT-5A se trataron durante 24 h en presencia de PLGA-CTRL y PLGA-His NP (97 µM [Gd] y 970 µM [B]). Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se renovó su medio. Los matraces tratados y los matraces que contenían células de control no tratadas se irradiaron durante 15 minutos a una potencia de reactor de 30 kW en la columna térmica del reactor TRIGA Mark II de la Universidad de Pavía, Italia. Al final de la irradiación, se retiró el medio, se reemplazó con medio fresco y los matraces se colocaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante otras 24 h. Al día siguiente, los matraces tratados y no tratados se separaron con tripsina/EDTA y se realizó el ensayo de exclusión con azul de tripano. La viabilidad de las células tratadas y no tratadas irradiadas se comparó con las no irradiadas. El porcentaje de células viables de cada condición se calculó ajustando el número de células no tratadas no irradiadas al 100 % de viabilidad.

El ensayo clonogénico de células tratadas y no tratadas irradiadas y no irradiadas se realizó sembrando alrededor de 200 células de cada matraz diferente en placas de cultivo de 6 cm de diámetro. Se siguió el crecimiento de las células durante 18 días. El medio se renovó después de 2-3 días. Después de 18 días, las células se lavaron con PBS, se fijaron en metanol (25') y se tiñeron con cristal violeta al 0,5 % (p/v) en etanol al 20 % (30'). El cristal violeta se eliminó con cuidado y se enjuagó con agua del grifo. Finalmente, el número de colonias se calculó mediante el software ImageJ. El % se calculó ajustando las células de control irradiadas al 100%.

La conjugación de PLGA con el oligo-His (Oligo-His-PLGA) se realizó siguiendo un procedimiento ya reportado28, basado en una reacción de adición de tiol-Michael entre PLGA-PEG2-maleimida y un oligo-His que contiene una cisteína N-terminal residuo (secuencia de aminoácidos: CGGHnβA, n = 15). Los PLGA-NP se prepararon siguiendo el método de extracción con solvente en emulsión o/w38 utilizando el 100 % del PLGA comercialmente disponible (MW = 7–17 kDa; denominado PLGA-CTRL) o mezclando el 50 % de este PLGA con el 50 % de Oligo-His- PLGA (PLGA-Su). El agente teranóstico AT101 (Esquema 1) se cargó en las NP añadiéndolo a la fase orgánica que contenía polímeros PLGA. Después de la diálisis se determinó la cantidad de AT101 que quedaba encapsulada con muy buenos rendimientos (> 82%), midiendo tanto B como Gd por ICP-MS. Los diámetros hidrodinámicos promedio de las nanopartículas de PLGA, la relajación milimolar y el potencial de superficie promedio de las nanopartículas se informan en la Tabla 1.

El potencial Z bajo y ligeramente negativo observado en ambas NP se debe al efecto de protección de las cargas negativas de PLGA causadas por el recubrimiento de PVA y DSPE-PEG39,40. Por la misma razón, solo se midió un ligero aumento del potencial Z en PLGA-His a pH < 6,5. Además, parte del oligo-His protonado puede permanecer en el núcleo de la partícula, reduciendo así su contribución al potencial Z medido (Tabla 1). Las nanopartículas se almacenaron a 4 °C y se midió su tamaño por DLS cada 15 días. Los resultados se reportan en la Tabla 2.

La relaxividad (r1p) es una expresión de la eficiencia del agente de contraste y corresponde a la contribución paramagnética a la tasa de relajación longitudinal normalizada a la concentración mM de la solución de complejo de Gd. Tanto PLGA-CTRL como PLGA-His muestran un valor de r1p 4-5 veces mayor (aprox. 18 s−1 mM−1, a 21,5 MHz y 25 °C, Tabla 1) con respecto a los observados con Gd- utilizado clínicamente. agentes de contraste a base de (en el rango de 4–5 mM−1 s−1)41. Esta es una indicación del largo tiempo de volteo ocupado por los complejos AT101 cuando se cargan en el NP y la sensibilidad mejorada reduce el límite de detección de estas sondas de imagen cuando se internalizan en un NP. La estabilidad a 37 °C del sistema de liberación se evaluó monitoreando durante 72 h las tasas de relajación de las soluciones de PLGA-NPs tanto a pH fisiológico como tumoral, en un tampón salino (tampón Hepes-NaCl). Para ello, las soluciones que contenían PLGA-CTRL y PLGA-His se agitaron a 37 °C, tanto a pH 7,4 como a 6,0, durante 72 h en diálisis (punto de corte 14 KDa). Las tasas de relajación de la solución de PLGA en la membrana de diálisis se midieron después de 3, 6, 24, 48 y 72 h de incubación. A pesar de que la Fig. 1 muestra que PLGA-CTRL son esencialmente estables durante 72 h en estas condiciones, en el caso de PLGA-His, se observó un aumento de R1 (s-1) cuando se incubaron a pH ácido, debido a la protonación de la grupos imidazol presentes en las NPs, con la consiguiente alteración de su estructura fisicoquímica produciendo un hinchamiento de las NPs que facilita la permeación del agua. El hinchamiento de la NP se confirmó midiendo el tamaño de PLGA-CTRL y PLGA-His después de 24 h de incubación a pH = 6,0 y 37 °C. De hecho, a pesar de que el diámetro hidrodinámico medido en PLGA-CTRL permaneció casi sin cambios (149,0 ± 4 nm), el diámetro medido de PLGA-His a pH 6,0 (160,4 ± 3,2 nm) aumentó aproximadamente un 12 %, lo que confirma el hinchamiento de las nanopartículas y el aumento de volumen. Además, como se informó en la introducción, las cadenas de oligohistidina muestran un pico de relajación característico a 1,38 MHz debido a la frecuencia de resonancia del cuadrupolo nuclear 14N de los grupos imidazol presentes en la cadena oligomérica, muy distinta de las QP generadas por el tejido de fondo. Dado que el pico de relajación cuadrupolar 14N solo puede observarse en sistemas inmovilizados, los cambios en la intensidad de los QP de imidazol pueden actuar como indicadores del estado físico del poli-His sólido/líquido y la hinchazón relacionada con el pH del microambiente. En la referencia 28 se demostró que la protonación del grupo imidazol de la histidina (pKa = 6,8) aumentaba el hinchamiento de las partículas y la solubilidad del polímero con el consiguiente aumento de la movilidad y desaparición progresiva de las QPs a pH < 6,0. Desafortunadamente, los QP no fueron detectables en PLGA-His utilizado en este trabajo, ya que el complejo Gd paramagnético cargado aumenta drásticamente la tasa de relajación y se convierte en el proceso de relajación predominante.

Tasas de relajación longitudinal (R1, s−1) de soluciones de HBS mantenidas a 37 °C durante un máximo de 72 h que contienen PLGA-CTRL a pH = 7,4 (O) y pH = 6 (círculo relleno) o PLGA-His a pH = 7,4 ( cuadrado abierto) y pH = 6 (cuadrado lleno).

Para confirmar esta hipótesis, se midió la concentración de Gd en las soluciones dentro de la membrana de diálisis (diluidas 1:1 con tampón) después de 0, 24 y 72 h de incubación a 37 °C a pH 7,4 y 6. Los resultados se reportan en La tabla 3 muestra que solo a pH 6 se observó una liberación significativa de AT101 después de 24 y 72 h de incubación, lo que confirma la estabilidad reducida de la nanopartícula a este pH.

Los estudios de captación se realizaron utilizando mesotelioma murino AB22 y, como control, líneas celulares de mesotelio sano humano MeT-5A, respectivamente. Las dos líneas celulares se incubaron durante 24 h con concentraciones crecientes de Gd tanto de PLGA-His como de PLGA-CTRL y después de 24 h se midió la cantidad de Gd y B internalizados mediante ICP-MS y se normalizó a las proteínas celulares totales. La figura 2 muestra que la captación de nanopartículas por las células tumorales AB22 parece aumentar en general en comparación con la línea de células mesoteliales sanas MeT-5A. Además, la absorción de las nanopartículas recubiertas de oligo-His parece mejorar aún más en la línea celular de mesotelioma AB22 en comparación con la nanopartícula no conjugada. En conclusión, la presencia de histidina en PLGA-His no afecta la captación de las NP en células sanas, lo que sugiere un mecanismo desencadenado por el pH específico que ocurre solo en células malignas, lo que hace que estas NP sean adecuadas para atacar específicamente este tipo agresivo de células tumorales.

El estudio de captación se realizó incubando una concentración creciente de Gd en PLGA-CTRL y PLGA-His en AB22 y MeT-5A durante 24 h a 37 °C, 5 % de CO2.

A partir de los datos obtenidos por análisis ICP-MS, al convertir mg de proteínas en número de células (1 mg de proteína corresponde a 1,7 y 6,3 millones de células para AB22 y MeT-5A, respectivamente) y suponiendo que en el caso de tumores epiteliales ( con un diámetro que oscila entre 15 y 20 μm), una densidad de ca. 108 células por cm3 es un número razonable para estos tejidos tumorales42, fue posible calcular las ppm máximas de B internalizadas en las células, reportadas en la Tabla 4.

Posteriormente, con el fin de evaluar si la concentración de AT101 internalizado era suficiente para la generación de una mejora de intensidad de señal de resonancia magnética detectable, se adquirió una imagen ponderada en T1 en células AB22 y MeT-5A incubadas con PLGA-CTRL o PLGA-His, ambas a 0,097 mM (concentración de Gd) y después de lavar, centrifugar las células en el fondo de capilares de vidrio. Como podemos observar en la Fig. 3, la absorción de las nanopartículas es consistente con los hallazgos anteriores, lo que sugiere una mayor absorción de PLGA-His en las células de mesotelioma en comparación con las sanas y también en comparación con las células incubadas con PLGA-CTRL.

Imagen de resonancia magnética T1w de capilares de vidrio que contienen sedimentos de células AB22 y MeT-5A incubados con PLGA-CTRL (3 y 6), PLGA-His (2 y 5) y células de control no tratadas (1 y 4).

Las células incubadas con nanopartículas de PLGA que encapsulaban AT101 se irradiaron con neutrones térmicos en el reactor nuclear Triga Mark II de la Universidad de Pavía. Para este conjunto de experimentos, se preincubaron células AB22 y MeT-5A durante 24 h en tres condiciones diferentes: (1) solo con medio (células CTRL), (2) con PLGA-CTRL y (3) con PLGA-His . Las PLGA-NP se incubaron a una concentración correspondiente a una concentración de Gd de 0,097 mM en el medio celular. Las células se irradiaron en la columna térmica durante 15' con una potencia de reactor de 30 kW. Como se muestra en la Fig. 4A, se detecta claramente un fuerte efecto citotóxico de BNCT en las células AB22, con una disminución significativa en el número de células 24 h después de la irradiación. De hecho, después de la irradiación, en comparación con el grupo control irradiado, el 30% de las células AB22 tratadas con PLGA-CTRL mueren, y con respecto a PLGA-His, el porcentaje aumenta al 60%. Por el contrario, las células MeT-5A no mostraron una disminución significativa 24 h después de la irradiación, en consonancia con la menor captación de NP de este tipo de células (como se muestra en la Fig. 2 y la Tabla 2). Esta observación está respaldada por los resultados obtenidos con el ensayo clonogénico realizado el día 18 después de la irradiación. De hecho, la Fig. 4B muestra que AB22 después de la irradiación, en particular si se trata con PLGA-His, deja de formar colonias. Estos resultados sugieren una disminución significativa en la capacidad de las células de mesotelioma para volver a adherirse y, cuando se tratan con NP de PLGA, son particularmente eficaces en el caso de la administración de PLGA-His. Por el contrario, las células sanas MeT-5A muestran solo una formación de colonias ligeramente reducida con respecto a las células de control no tratadas irradiadas.

(A) Recuento celular normalizado 24 h después de la irradiación con neutrones, realizado en AB22 y MeT-5A previamente tratados con PLGA-CTRL o PLGA-His y comparado con células no tratadas. La significación estadística se determinó mediante la prueba T de Student (***P < 0,01); (B) ensayo clonogénico realizado 18 días después de la irradiación con neutrones. El número de colonias se calculó mediante el software ImageJ. El % se calculó ajustando las células de control irradiadas al 100%.

El mesotelioma es un cáncer agresivo que se asocia con la exposición al asbesto. Aunque el asbesto está prohibido en varios países, se pronostica que una epidemia de mesotelioma afectará a los países de ingresos medios durante este siglo debido a su alto consumo de asbesto. Los pacientes afectados por esta enfermedad suelen presentar un mal pronóstico debido a la falta de terapias significativas y efectivas ya que la quimioterapia convencional no logra afectar y erradicar este subtipo de cáncer de manera efectiva43. Aunque trabajos recientes han encontrado importantes posibilidades de tratamiento, identificando vulnerabilidades genéticas y fisiopatológicas, el mesotelioma sigue siendo uno de los cánceres con menor tasa de supervivencia. Por lo tanto, en este artículo, debemos demostrar la posibilidad de un enfoque innovador, basado en la terapia de captura de neutrones de boro, con un compuesto teranóstico administrado por nanopartículas de PLGA. Desarrollamos y caracterizamos nanopartículas de PLGA que contienen cadenas de polihistidina, capaces de retener el compuesto teranóstico AT101 de manera efectiva y entregarlo específicamente a las células tumorales, aprovechando así al máximo esta radioterapia predirigida. En este artículo se demostró cómo estas nanopartículas son absorbidas preferentemente por el mesotelioma que por las células mesoteliales sanas, lo que sugiere la posibilidad de un enfoque terapéutico específico en la cura de esta terrible enfermedad. En consecuencia, las células de mesotelioma AB22 se vieron fuertemente afectadas por la irradiación de neutrones causando su daño irreversible, mientras que un alto porcentaje de células sanas se salvó con el mismo tratamiento, como también lo demostró el ensayo clonogénico. Por lo tanto, proponemos BNCT como una posible estrategia terapéutica alternativa para tratar el mesotelioma.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el estudio actual se compartirán previa solicitud. Las solicitudes deben dirigirse al autor de correspondencia.

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La investigación que condujo a estos resultados recibió financiamiento de AIRC bajo IG 2019—ID. 23267 (PI Geninatti Crich Simonetta) y del proyecto del Instituto Nacional Italiano de Física Nuclear: Enter_BNCT y el Ministerio italiano de Universidades e Investigación (MUR) para la financiación anual de FOE para el nodo italiano de imágenes moleculares multimodales Euro-BioImaging (MMMI).

Departamento de Biotecnología Molecular y Ciencias de la Salud, Universidad de Turín, Via Nizza 52, 10126, Turín, Italia

Jacopo Sforzi, Diego Alberti, Valeria Bitonto y Simonetta Geninatti Crich

Departamento de Química, Universidad de Turín, Via P. Giuria 7, 10125, Turín, Italia

Alberto Lanfranco, Stefano Parisotto, Polyssena Renzi y Annamaria Deagostino

Departamento de Ciencia e Innovación Tecnológica, Universidad del Piamonte Oriental, 15121, Alessandria, Italia

raquel estefanía

Departamento de Física, Universidad de Pavía, Via Agostino Bassi 6, 27100, Pavía, Italia

Nicoletta Protti y Saverio Altieri

Instituto Nacional de Física Nuclear (INFN), Unidad de Pavía, Via Agostino Bassi 6, 27100, Pavía, Italia

Nicoletta Protti y Saverio Altieri

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Conceptualización: SGC, AD, JS; metodología: SGC, AD, JS, DA, SA; investigación: JS, DA, AL, PR, SP, RS, NP, BV; análisis: JS, DA, VB, AL redacción—borrador original: SGC, JS, DA; redacción—revisión y edición: AD, PR, AL, SP, SGC, SA, NP; adquisición de fondos: SGC, AD, SA, NP

Correspondencia a Annamaria Deagostino o Simonetta Geninatti Crich.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sforzi, J., Lanfranco, A., Stefania, R. et al. Una nueva nanopartícula de PLGA teranóstico sensible al pH para la terapia de captura de neutrones de boro en el tratamiento del mesotelioma. Informe científico 13, 620 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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Recibido: 13 noviembre 2022

Aceptado: 04 enero 2023

Publicado: 12 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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