Blog

Sep 27, 2023

Síntesis vs recuperación de éster

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 306 (2023) Citar este artículo

664 Accesos

1 Altmetric

Detalles de métricas

Toxoplasma gondii es un patógeno zoonótico prevalente que infecta tanto al ganado como a los humanos. La capacidad excepcional de este parásito para reproducirse en varios tipos de células huésped nucleadas requiere un uso coordinado de recursos nutricionales endógenos y derivados del huésped para la biogénesis de la membrana. La fosfatidiletanolamina es el segundo glicerofosfolípido más común en T. gondii, pero sigue siendo un misterio cómo se satisface su requerimiento en la etapa de taquizoíto de división rápida agudamente infecciosa. Este trabajo revela que el parásito implementa vías de recuperación y síntesis de novo para satisfacer su demanda de PtdEtn unido a éster y éter. El agotamiento de la fosfoetanolamina citidililtransferasa (ECT) mediada por auxina causó un fenotipo letal en los taquizoítos debido a la alteración de la invasión y la división celular, revelando un papel vital de la vía CDP-etanolamina durante el ciclo lítico. De acuerdo, el complejo de la membrana interna apareció interrumpido junto con una disminución en su longitud, ancho del parásito y fosfolípidos principales. La lipidómica integrada y los análisis de isótopos del mutante TgECT revelaron la síntesis endógena de éster-PtdEtn y la recuperación de lípidos unidos a éter de las células huésped. En resumen, este estudio demuestra cómo T. gondii opera varios medios para producir distintas formas de PtdEtn al tiempo que presenta la relevancia terapéutica de su síntesis de novo.

El filo de protozoos Apicomplexa comprende muchos patógenos intracelulares comunes, como Toxoplasma, Plasmodium, Eimeria y Cryptosporidium. Toxoplasma gondii, la única especie conocida del género, tiene una notable capacidad para infectar muchos tipos de células nucleadas en varios vertebrados; por lo tanto, es reconocido como uno de los patógenos más exitosos. La infección natural de los huéspedes por T. gondii comienza por la ingestión de los ooquistes o quistes en el alimento contaminado. Los estadios de esporozoíto y bradizoíto liberados del ooquiste o del quiste, respectivamente, infectan el epitelio gástrico y se convierten en un estadio de taquizoíto altamente infeccioso, promiscuo y de rápida división, que se reproduce en otros tejidos y eventualmente causa necrosis por ciclos líticos perpetuos1,2. Bajo estrés físico-químico e inmunológico, algunos taquizoítos se diferencian en bradizoítos enquistados, estableciendo una infección crónica. Para la reproducción intracelular dentro de las células huésped, el parásito debe producir suficiente biomasa de membrana a través de sus vías de síntesis y recuperación, muchas de las cuales otorgan excelentes dianas terapéuticas antiparasitarias3,4.

Los glicerofosfolípidos constituyen un ingrediente principal de las biomembranas en los taquizoítos de T. gondii4,5,6,7,8. La fosfatidilcolina (PtdCho), la fosfatidiletanolamina (PtdEtn), la fosfatidiltreonina (PtdThr), la fosfatidilserina (PtdSer), el fosfatidilinositol (PtdIns), el fosfatidilglicerol (PtdGro) y el fosfatidato (PtdOH) son fosfolípidos típicos presentes en los taquizoítos y necesarios para el óptimo ciclo lítico5,7, 9,10,11,12. Además de sus funciones habituales para la replicación del parásito, muchos fosfolípidos han surgido recientemente como actores clave en la homeostasis del calcio y la transducción de señales, lo que contribuye a la motilidad deslizante, la invasión y la salida de los taquizoítos7,12,13,14,15. El parásito es capaz de sintetizar fosfolípidos utilizando precursores adquiridos de la célula huésped5,7,9,10,11,12,16,17,18,19. Además, puede salvar ciertas especies/sondas de fosfolípidos del medio extracelular y/o intracelular12,18,20.

PtdEtn es el segundo fosfolípido más común en los taquizoítos, presente en formas unidas por éster y éter5,6,7. Varias rutas pueden producir éster-PtdEtn, incluidas distintas PtdSer descarboxilasas (PSD) ubicadas en la mitocondria del parásito y la vacuola parasitófora, CDP-etanolamina, también conocida como la ruta de Kennedy en el retículo endoplásmico, y a través de la inversión mediada por P4-ATPasa en la membrana plasmática5,10, 20,21. Su síntesis endógena a través de la vía de la CDP-etanolamina requiere un andamio de diacilglicerol que puede ser generado por los taquizoítos18. Aunque aún no se ha estudiado en T. gondii, la PtdEtn unida a éter contiene un esqueleto de alquilglicerol elaborado por una alquilglicerona fosfato sintasa en células de mamíferos22. En términos funcionales, la forma cónica del éster-PtdEtn contribuye a la curvatura de la membrana, regulando los eventos de gemación, fusión y fisión y facilitando así las interacciones membrana-proteína23. Por otro lado, la forma de éter-PtdEtn permite un enlace de hidrógeno intermolecular más fuerte entre los grupos de cabeza, lo que resulta en una disminución de la fluidez de la membrana22,24.

Este trabajo examinó la biogénesis y la relevancia fisiológica de éster y éter-PtdEtn durante el ciclo lítico de los taquizoítos de Toxoplasma. Estudiamos la fosfoetanolamina citidililtransferasa (ECT), que cataliza la fosfoetanolamina derivada de la etanolamina quinasa a CDP-etanolamina en el citosol del parásito. Nuestros datos muestran que la TEC es esencial para la reproducción asexual de taquizoítos en células humanas. Su agotamiento condicional por mutagénesis afecta la cantidad y la síntesis de especies de éster-PtdEtn, mientras que el éter-PtdEtn no se ve afectado. Del mismo modo, descubrimos que los parásitos intracelulares podrían salvar PtdEtn unido a éter de las células huésped.

Nuestro trabajo anterior informó la aparición de una vía funcional de CDP-etanolamina en los taquizoítos5, aunque no pudimos identificar una alquil-glicerona fosfato sintasa potencial en el genoma del parásito. En los siguientes estudios, describimos la primera y última enzimas de la síntesis de PtdEtn de novo, es decir, la etanolamina quinasa (EK) y la etanolamina fosfotransferasa9,10. Aquí, identificamos la proteína ECT, que utiliza fosfoetanolamina y CTP como sustratos para producir CDP-etanolamina25. Al comparar con los homólogos de los organismos modelo, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Mus musculus y Trypanosoma brucei, encontramos un ECT potencial en el genoma de Toxoplasma (TGGT1_310280, Fig. 1). A diferencia de los ECT de mamíferos y cinetoplastidos, que abarcan alrededor de 400 residuos y forman clados separados, los homólogos de apicomplexan son mucho más largos y forman su propio clado distinto. PfECT y EfECT codifican 573 y 665 residuos, respectivamente, mientras que TgECT contiene 1128 aminoácidos. Los ECT de apicomplexan poseen una extensión N-terminal inusual de> 100 residuos en comparación con los homólogos canónicos. TgECT es excepcional con una extensión larga de aproximadamente 500 aminoácidos, lo que da como resultado una proteína 3 veces más grande que sus contrapartes no apicomplejas (Fig. 1a).

a Estructura primaria y proximidad filogenética de etanolamina citidililtransferasas de protistas parásitos representativos y huéspedes mamíferos. Las secuencias de proteínas recuperadas de las bases de datos Uniprot o NCBI fueron alineadas por Clustal W, y el filograma fue construido por el software MEGA 11 (método de máxima verosimilitud, modelo de matriz JTT). La alineación de los ECT se puede ver en la Fig. 1 complementaria. b Un modelo de homología tridimensional de los dominios de citidililtransferasa en TgECT (derecha) y su superposición con la estructura cristalina de HsECT (gris, PDB: 3ELB, izquierda). c Esquema que indica el etiquetado genómico 3′ de TgECT con un epítopo smHA. d PCR genómica que confirma la integración de la etiqueta smHA y el marcador de selección DHFR-TS en el locus ECT. Se usaron PCR1 y PCR2 para probar el locus transgénico, mientras que PCR3 se incluyó como control para la cepa parental. e Inmunotransferencia que muestra la expresión de TgECT marcada con smHA en la cepa transgénica. El asterisco (*) representa la banda TgECT-smHA correcta (180 kDa). Otras bandas de menor tamaño son posibles productos de degradación de TgECT-smHA. f Colocalización inmunofluorescente de TgECT-smHA con TgALD en taquizoítos (24 h después de la infección). Los cultivos parasitados se marcaron usando anticuerpos α-HA y α-TgALD.

TgECT alberga dos dominios de citidililtransferasa en tándem de alrededor de 100 a 150 residuos separados por una región enlazadora, análoga a sus contrapartes en otros organismos. Esto contrasta con el CTP bacteriano: glicerol-3-fosfato citidililtransferasa o CTP eucariótico: fosfocolina citidililtransferasa (CCT), que contiene un solo dominio CT. La alineación de secuencias de los dominios ECT típicos también identificó residuos conservados (Figura 1 complementaria). Todos los motivos característicos de la familia de citidililtransferasa están presentes en TgECT: HSGH y HVGH; un motivo RTEGISTS; Regiones KWVDEVI y RVVDEVI (Figura 1 complementaria). El modelado de homología de los dominios TgECT basado en la estructura HsECT (código PDB, 3ELB) sugiere que HSGH, HVGH y RTEGISTS están involucrados en la formación de un centro catalítico, mientras que KWVDEVI y RVVDEVI permiten la dimerización de los dominios CT N- y C-terminales. (Figura 1b). El dominio CT N-terminal en HsECT y PfECT es fundamental para su actividad catalítica26,27, lo que probablemente sea cierto para TgECT (Fig. 1a).

El primer paso de la vía de la CDP-etanolamina que produce fosfoetanolamina ocurre en el citosol9, y la tercera/última reacción que sintetiza PtdEtn ocurre en el retículo endoplásmico10. Aquí, examinamos la localización de ECT para descifrar la ubicación subcelular de la formación de CDP-etanolamina. Generamos una cepa de parásito transgénico que expresa ECT fusionada con un monstruo de espagueti C-terminal (10xHA) mediante etiquetado genómico 3′. Un amplicón donante con las secuencias de homología 5 'y 3' que flanquean el casete de expresión DHFR-TS resistente a la pirimetamina (marcador de selección) se cotransfectó en taquizoitos con una construcción CRISPR que codifica Cas9 y un sgRNA específico de gen (Fig. 1c). Los parásitos resistentes a los medicamentos se clonaron mediante dilución limitante y se seleccionaron mediante PCR genómica para la integración en el locus deseado (Fig. 1d). Además, confirmamos el marcado exitoso por transferencia Western, revelando una banda esperada de 180 kDa correspondiente a TgECT-smHA en la cepa transgénica pero no en la parental (Fig. 1e). La tinción inmunofluorescente reveló una distribución punteada de ECT-smHA dentro del parásito, coubicándose con un marcador citosólico conocido, la aldolasa (TgAld)28,29 (Fig. 1f). Para evaluar la relevancia fisiológica de la TEC durante el ciclo lítico, intentamos eliminar el gen en los taquizoítos a través de la recombinación homóloga doble asistida por CRISPR/Cas9. Sin embargo, nuestros múltiples experimentos para lograr un mutante knockout viable fueron inútiles, lo que implica que esta proteína es indispensable para la supervivencia de los taquizoítos.

En el siguiente trabajo, creamos un mutante condicional de TgECT basado en un degron inducido por auxina, que dirige las proteínas etiquetadas a la degradación proteasómica tras la incubación con ácido indol-3-acético (IAA)30. Se cotransfectó una construcción CRISPR/Cas9 que codifica Cas9 y sgRNA para escindir el ECT-3'UTR con un amplicón para la reparación dirigida por homología en el locus objetivo en los taquizoítos. La secuencia donante contenía brazos de homología 5 'y 3' (40 pb cada uno) que flanqueaban el motivo AID-3xHA para el marcado de inserción 3' y el marcador de selección DHFR-TS (Fig. 2a). La integración genómica se examinó mediante detección por PCR utilizando cebadores específicos de cruce (Fig. 2a, b), lo que confirmó el etiquetado del gen 3', que se verificó mediante secuenciación de ADN. De acuerdo con TgECT-smHA (Fig. 1f), la ECT marcada con AID-3xHA estaba presente en el citosol que se colocalizaba con TgHSP90, otro marcador citoplasmático31 (Fig. 2c). La inmunotransferencia reveló una proteína de ~180 kDa correspondiente a ECT marcada con AID-3xHA en la cepa transgénica cultivada sin IAA, mientras que la señal puede agotarse rápidamente dentro de 1 h del tratamiento con IAA (Fig. 2d). El rápido agotamiento de ECT por IAA se confirmó mediante un ensayo de inmunofluorescencia (Fig. 2e, Fig. 2 complementaria).

a El marcado en 3′ mediado por CRISPR/Cas9 del gen TgECT con un grado inducible por auxina y 3xHA. La construcción pU6-Cas9-TgECTsgRNA (que codifica Cas9 y sgRNA específico de ECT) se transfectó con un amplicón de donante (AID-3xHA-3′UTRGra1-DHFR-TS flanqueado por brazos de homología 5′/3′ de 40 pb) en el Cepa parental RHΔku80-Δhxgprt-TIR1. Los taquizoítos resistentes a la pirimetamina que expresan DHFR-TS se clonaron y examinaron mediante PCR. La eventual cepa TgECT-AID-3xHA permitió la regulación negativa condicional de ECT por el ácido indol-3-acético (IAA). b PCR de detección específica de recombinación para descifrar la integración de AID-3xHA en el locus ECT (ver cebadores en a). PCR4/PCR5 y PCR6 indican la prueba de loci transgénicos y nativos, respectivamente. c Imágenes inmunofluorescentes que confirman la colocalización de TgECT y TgHSP90 en el mutante. d, e Expresión dependiente de IAA de ECT marcada con AID-3xHA mostrada por métodos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia. Los parásitos se cultivaron en ausencia o presencia de IAA 100 μM durante los períodos de tiempo indicados. La inmunotinción se realizó utilizando anticuerpos α-HA y α-TgHSP90 (d) o α-HA y α-TgGAP45 (e). La cantidad equivalente de proteína de cada muestra se resolvió en SDS-PAGE al 8% para transferencia, seguido de inmunotinción. f, g Placas producidas por TgECT-AID-3xHA y cepas parentales (-/+IAA). Las imágenes teñidas con cristal violeta revelan placas (área blanca irregular) formadas por ciclos líticos sucesivos de las cepas indicadas en monocapas de HFF confluentes (azul). El tamaño de la placa, cuantificado por ImageJ, se presenta en unidades arbitrarias (au). Se puntuaron 150–200 placas de cada cepa (n = 3 ensayos; medias ± SE; ***p ≤ 0,001).

Un mutante condicional nos permitió evaluar la importancia de la TEC para el ciclo lítico del parásito en células HFF. Establecimos ensayos de placa, que indican la aptitud de crecimiento general de T. gondii (Fig. 2f, g). La cepa parental exhibió un crecimiento normal independientemente del IAA en cultivo, al igual que el mutante TgECT-AID-3xHA en ausencia de auxina. Por el contrario, el agotamiento de ECT inducido por IAA detuvo el crecimiento del parásito, como es evidente por la falta de placas en la monocapa de células huésped. Estos resultados concuerdan con la observación anterior de que el gen ECT no se puede eliminar, lo que determina su papel fisiológicamente crítico en T. gondii.

A continuación, examinamos la causa de un fenotipo letal en cultivos de taquizoítos empobrecidos en ECT mediante ensayos adicionales, como la replicación, la endodiogenia (getación celular), la salida, la invasión y la motilidad deslizante (Fig. 3). Para los dos primeros experimentos, elegimos puntos de tiempo correspondientes a cultivos parasitados tempranos (24 h) y tardíos (40 h) (Fig. 3a, b). La replicación se cuantificó enumerando 'parásitos por vacuola' y calculando la fracción de vacuolas con números variables de progenie. A diferencia de la cepa parental, que no se vio afectada por IAA, el mutante ECT tenía una fracción mucho mayor de vacuolas pequeñas (1 a 8 parásitos) en cultivos tratados con auxina en ambos puntos de tiempo en comparación con las muestras no tratadas (Fig. 3a). Las grandes vacuolas con >16 parásitos apenas estaban presentes en condiciones de agotamiento de ECT, en contraste con los cultivos de control. De acuerdo, la evaluación de la endodiogenia demostró una formación de células hijas fuertemente deteriorada solo en el mutante TgECT-AID-3xHA tratado con IAA (Fig. 3b).

a, b La replicación y la eficiencia de gemación de las cepas TgECT-AID-3xHA y parentales (-/+IAA). Los taquizoítos teñidos con TgGAP45 que se replican dentro de las vacuolas se trazaron (parásitos/vacuola) para reflejar la tasa de proliferación de cada cepa (a). Para ver un gráfico de barras simplificado con puntos de datos, consulte la Fig. 6 complementaria. La gemación de las células hijas se calculó en función de la cuantificación de las vacuolas positivas para TgIMC3 que albergan taquizoítos con progenie (b). Los gráficos de barras se basan en 400–500 vacuolas para cada muestra. c, d Tasas de salida de las cepas mutantes y parentales de ECT en condiciones de -/+ IAA. Para la salida natural (c) e inducida por zaprinast (d), los resultados se obtuvieron contando 30 campos aleatorios con >200 vacuolas parasitóforas. e Eficiencia de invasión de las cepas indicadas (-/+IAA). Se puntuaron un total de >1000 eventos para los gráficos de barras mostrados. f Motilidad deslizante de los taquizoítos. Los parásitos teñidos con TgSAG1 se analizaron para la fracción móvil (200–400 células, n = 4 ensayos) y la longitud del rastro (>60 rastros por grupo, excepto para TgECT-AID-3xHA tratados con IAA (13 rastros)). g El rendimiento de taquizoítos (−/+IAA). Se infectaron monocapas de HFF (106 células) con las cepas indicadas (MoI = 1) y se cultivaron durante 48 h con o sin IAA, seguido de recuento de parásitos. Los (a–g) muestran datos de n = 3 o más experimentos (medias ± SE; *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001).

El mutante condicional también exhibió un defecto en la salida natural luego de la finalización de la replicación de taquizoitos (Fig. 3c). Calificamos la salida inducida en respuesta a zaprinast para probar si el fenotipo observado se debió a una replicación lenta y no a una señalización de salida deteriorada. Este potente inhibidor de la fosfodiesterasa desencadena una salida prematura de taquizoítos intracelulares al activar la señalización de cGMP32,33. De hecho, el fenotipo de salida fue rescatado por zaprinast (Fig. 3d), lo que implica una cascada de señalización integral. En particular, los parásitos empobrecidos en ECT invadieron muy mal las células huésped (Fig. 3e), lo que sugiere la incapacidad del mutante para establecer una nueva infección. Dado que el proceso de invasión está impulsado por la motilidad deslizante, analizamos el último fenotipo (Fig. 3f). Nuestros datos revelaron una marcada disminución en la fracción móvil y la longitud del rastro del mutante expuesto a IAA, pero no en las muestras de control. Los defectos observados en la motilidad, invasión y replicación del parásito culminaron en una proliferación muy reducida del mutante condicional incubado con auxina. Su recuento de taquizoítos (rendimiento de parásitos) se redujo en ~90 % con el tratamiento con IAA en comparación con los cultivos de control (Fig. 3g).

La motilidad del apicomplejo y los eventos de invasión y salida dependientes de la locomoción son impulsados ​​por un motor de actina-miosina (glideosoma) incrustado en el complejo de la membrana interna (IMC)34. La tinción de las células hijas (Fig. 3b) apuntó a un orgánulo defectuoso, que examinamos visualizando TgGAP45, una proteína bien caracterizada esencial para la función del glideosoma35,36, en taquizoítos de la cepa TgECT-AID-3xHA (Fig. 4a ). El cultivo de mutantes con IAA durante 24 y 48 h dio como resultado parásitos evidentemente estrechos y acortados en comparación con la cepa parental (Fig. 4a). Para consolidar nuestra observación, medimos la longitud y el ancho del IMC marcado con TgGAP45. Se registró una disminución significativa en estas dos dimensiones en ambos puntos de tiempo después del tratamiento con IAA. Mientras que la longitud de IMC se redujo en un 10% (Fig. 4b), su ancho de taquizoítos disminuyó en un 25% tras la exposición a la auxina (Fig. 4c). Suponiendo una contribución de ECT en la biogénesis de la membrana, también visualizamos otros orgánulos mediante inmunotinción, como micronemas (MIC2), membrana plasmática (SAG1), apicoplasto (ferredoxina) y mitocondria (HSP60) (Fig. 2 complementaria). No se apreció ninguna anomalía morfológica en ninguno de los orgánulos inmunoteñidos. También implementamos microscopía electrónica de transmisión para descifrar los posibles defectos de organelos en el mutante agotado en TgECT (Fig. 3 complementaria), que no mostró un fenotipo distinto en comparación con el control no tratado o la cepa parental (-/+IAA), determinando nuestro inicial hallazgos por ensayos de inmunofluorescencia indirecta.

Se cultivaron taquizoítos de la cepa TgECT-AID-3xHA (-/+ IAA), seguido de inmunotinción de TgGAP45. Los núcleos fueron visualizados por DAPI. b, c La longitud de IMC y el ancho de los taquizoítos en las cepas transgénicas y parentales después de cultivar con o sin auxina durante 24 h y 48. ImageJ analizó imágenes de 30 vacuolas parasitóforas, cada una con 4 taquizoítos, para calcular los parámetros indicados. (n = 3 ensayos, medias ± SE; ***p ≤ 0,001).

Dado el papel putativo de ECT en la síntesis de PtdEtn, realizamos un análisis lipidómico de TgECT-AID-3xHA y cepas parentales (Fig. 5). Los lípidos totales se aislaron de los parásitos, se resolvieron y analizaron por HPLC-MS. En comparación con los controles mutantes parentales y no tratados, observamos una disminución de aproximadamente el 50% en el contenido de fosfolípidos de la cepa empobrecida en ECT (Fig. 5a). Se observó una disminución significativa en todas las clases principales de fosfolípidos del mutante tratado con IAA, mientras que no se observaron cambios en la cepa parental (Fig. 5b). La abundancia de lípidos mostrados se desplomó entre un 30 y un 50 % tras el agotamiento de la TEC. También medimos los niveles de éster y PtdEtn unido a éter (Fig. 5c). Ninguno se alteró en cultivos de -/+ IAA de la cepa parental. Una caída de ECT en el mutante provocó una disminución en el éster-PtdEtn pero no en el éter-lípido (Fig. 5c). Por lo tanto, la proporción de éster frente a éter-PtdEtn cambió de 2,6:1 en cultivos no tratados a 1,1:1 en el mutante empobrecido en ECT.

a Contenido comparativo de fosfolípidos de las cepas TgECT-AID-3xHA y parental. Los parásitos se cultivaron (-/+IAA), seguido de un análisis lipidómico (n = 4 ensayos). Se presenta la abundancia relativa de cada fosfolípido en las muestras tratadas con IAA en comparación con el cultivo de control no tratado (−IAA, 100 %). b Abundancia relativa de clases estándar de fosfolípidos en taquizoítos de las cepas especificadas (-/+IAA). c Cambios en las agrupaciones de PtdEtn unidas a éster y éter de los taquizoítos mutantes y parentales. Los datos en (a–c) muestran las medias con SE (n = 4 ensayos). La significación estadística se calculó comparando las muestras +IAA con −IAA (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001).

A continuación, trazamos la magnitud del cambio en todas las especies de fosfolípidos detectables, independientemente de la abundancia, como gráficos de volcanes para ilustrar el cambio de pliegue frente a la significación estadística sobre la pérdida de ECT inducida por IAA (Fig. 6a, b). Ninguna de las especies de lípidos en la cepa parental se vio afectada por encima de un umbral de ≥2 veces (valor de p ≤ 0,01) (Fig. 6a). La cepa TgECT-AID-3xHA, por otro lado, mostró una regulación sustancial de varias especies de lípidos correspondientes a PtdCho, PtdEtn, PtdIns, PtdSer, PtdThr, lyso-PtdCho y lyso-PtdIns (Fig. 6b, Figs. 4–5 complementarias). ). Entre los ésteres-fosfolípidos regulados a la baja, las especies PtdEtn, PtdSer y PtdThr fueron las más evidentes (Fig. 6b). Algunos otros, a saber, C36: 1, C38: 4, C40: 5 PtdEtn, C42: 5 PtdSer, C36: 4, C38: 1 PtdCho y C20: 4 lyso-PtdIns estaban regulados al alza. Curiosamente, los lípidos de éter que pertenecen singularmente a PtdEtn y PtdCho estaban regulados al alza o inalterados en el mutante (Figs. 6b, 7a).

a Gráficos volcánicos de las cepas parentales y TgECT-AID-3xHA (abajo) para representar cambios en especies de fosfolípidos individuales tras la exposición a IAA. Se usaron umbrales definidos de cambio de pliegue (≥2x) y valor de p corregido por tasa de descubrimiento falso (≤0.01) para identificar lípidos significativamente alterados (n = 4 ensayos). Los círculos de diferentes tamaños, que representan especies individuales, se escalan a la abundancia; los que están por encima del umbral indicado están coloreados según la clase de fosfolípidos, mientras que los demás se muestran en gris. b Mapas de calor que muestran los cambios en las especies de lípidos elegidas de (a). La letra de prefijo "A" indica la forma de éter de PtdCho y PtdEtn. Los datos de lipidómica están disponibles en las hojas de Excel (Hoja de datos del suplemento 1–2).

a La abundancia relativa de especies de PtdEtn unidas a éster y éter se alteró significativamente tras el tratamiento de TgECT-AID-3xHA con IAA (Fig. 6). b Esquema para el etiquetado de isótopos estables de taquizoitos mutantes TgECT-AID-3xHA extracelulares e intracelulares (-/+IAA) con [13C2]-etanolamina y [13C2]-PtdEtn derivado del huésped, respectivamente. Para el último ensayo, los HFF se cultivaron en [13C2]-etanolamina para marcar PtdEtn, seguido de la propagación de taquizoitos para probar la recuperación de [13C2]-PtdEtn. La incorporación de [13C2] en especies de éster y éter-PtdEtn de parásitos purificados se juzgó mediante análisis lipidómico. c, d Enriquecimiento de [13C2]-etanolamina en especies de PtdEtn unidas a éster y éter de taquizoítos extracelulares e intracelulares, como se describe en (b). Los datos en (a, c, d) muestran las medias con SE (a, n = 4 ensayos; c, d, n = 5 ensayos).

La síntesis interconectada de fosfolípidos nos motivó a encontrar patrones en su corregulación. Una pérdida de ECT alteró varias especies, especialmente las compartidas por PtdSer, PtdThr y PtdEtn. C34:2, C38:6, C38:7, C40:7 PtdSer y C38:6, C38:7 PtdThr coincidieron con la tendencia de las especies PtdEtn (Fig. 4 complementaria), lo que sugiere su síntesis por las enzimas PSS y PTS de intercambio de bases en T. gondii7. Apenas hubo una especie común de PtdEtn y PtdCho (Fig. 6b), lo que ratifica la falta de una metiltransferasa lipídica5. Del mismo modo, no se observó ninguna correlación de las especies de PtdEtn con PtdIns, como se esperaba por las rutas soberanas de sus síntesis12,25. Sorprendentemente, algunas especies de PtdCho (36:4, 38:1), PtdEtn (36:1, 38:4, 40:4, 40:5) y PtdSer (42:5) fueron inducidas en el mutante privado de ECT ( Figura complementaria 3b), que apunta a un mecanismo de contrapeso. Sin embargo, ninguna de las especies de PtdEtn especificadas se marcó con 13C2 en taquizoítos extracelulares o en aquellas cultivadas en células huésped premarcadas (Fig. 7b, c, ver más abajo). Tales especies de éster-PtdEtn probablemente estén formadas por PSD10,21.

A diferencia de su forma de éster, las especies de éter-PtdEtn aumentaron o no se vieron afectadas (Fig. 7a), lo que nos llevó a buscar las enzimas de la síntesis de éter-PtdEtn en T. gondii. Como se mencionó anteriormente, nuestro análisis bioinformático no encontró un candidato adecuado en el genoma del parásito. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la vía de Kennedy proporciona la PtdEtn unida a éster y la producción de éter-lípidos depende del entorno del parásito. Para probar esta premisa, realizamos el etiquetado de isótopos (13C2-etanolamina) seguido de un análisis lipidómico, lo que nos permitió distinguir las especies de PtdEtn sintetizadas por el parásito de las recuperadas de las células huésped (Fig. 7b). Similar al etiquetado de PtdIns12 con 13C6-mio-inositol informado anteriormente, se analizaron parásitos sin huésped marcados con 13C2-etanolamina para discernir el PtdEtn hecho endógenamente. Al mismo tiempo, se desplegaron taquizoítos cultivados en células huésped premarcadas para deducir la aparición de una vía de recuperación.

El análisis lipidómico de los parásitos extracelulares reveló un enriquecimiento de 13C2-etanolamina en varias especies de éster-PtdEtn, como C34:1 (>5 veces), C34:2 (∼11x), C36:2 (∼10x), C38:4 (∼6x) y C40:5 (∼6x) (Fig. 7c), lo que confirmó la presencia de una vía funcional de CDP-etanolamina5,10. El agotamiento de ECT mediado por IAA afectó el etiquetado de isótopos de las especies C34: 1, C34: 2 y C36: 2, de acuerdo con la disminución observada en su contenido (Fig. 7a). Por el contrario, el etiquetado 13C2 de C38: 4 y C40: 5 PtdEtn no se vio afectado por IAA (Fig. 7c) de acuerdo con sus niveles aumentados o sin perturbaciones (Fig. 7a). Los taquizoitos cultivados en células huésped marcadas con 13C2-etanolamina no mostraron enriquecimiento isotópico en ninguna de las especies de éster-PtdEtn, lo que descarta la recuperación de estos lípidos (Fig. 7c). Inversamente, fuimos testigos de un fenómeno opuesto para las especies de éster-PtdEtn (A34: 2, A36: 5) que estaban enriquecidas con 13C2 (∼4–5x) en parásitos que crecieron intracelularmente pero no en parásitos libres (Fig. 7d). Otras especies de lípidos (A38: 5, A38: 6, A40: 6) se etiquetaron por igual en ambas configuraciones (∼ 2–3x) y, como se esperaba, no se observaron cambios en el etiquetado 13C2 de éter-PtdEtn al agotarse la TEC. Los datos implican que las especies de éster-PtdEtn se sintetizan principalmente de novo utilizando la ruta de CDP-etanolamina, mientras que el parásito recupera especies de PtdEtn unidas a éter de su célula huésped.

Comprender la base metabólica del parasitismo intracelular en parásitos apicomplexan ha sido fundamental para la investigación de patógenos-huéspedes. Durante las últimas tres décadas, Toxoplasma gondii se ha convertido en un parásito modelo para descubrir la biología de los apicomplejos debido a la relativa facilidad de cultivo y las herramientas avanzadas para la ingeniería genómica y el fenotipo mutante. Aunque se ha estudiado activamente, la biosíntesis de lípidos, el tráfico, el rescate, la detección y la señalización siguen siendo poco apreciados en Apicomplexa. Al explorar una fosfoetanolamina citidililtransferasa (ECT), este trabajo determinó que los taquizoítos de T. gondii implementan distintas rutas para satisfacer su necesidad de especies PtdEtn unidas a éster y éter (Fig. 8). Mientras que los primeros lípidos se generan a través de la vía de Kennedy, el segundo tipo se recupera de las células huésped. La ECT es una proteína esencial que facilita la invasión y replicación del parásito durante el ciclo lítico. Estas características y su divergencia filogenética de los homólogos de mamíferos hacen de la TgECT un excelente objetivo farmacológico para la inhibición terapéutica de la toxoplasmosis aguda.

El modelo se basa en este trabajo y en el trabajo anterior citado en este documento. Los taquizoítos despliegan múltiples rutas para producir PtdEtn. La demanda de éster-PtdEtn se satisface principalmente a través de las vías CDP-etanolamina y PSD1mt. El primero impulsa la síntesis de novo de éster-PtdEtn en el RE, mientras que el último genera PtdEtn al descarboxilar PtdSer en la mitocondria. La ECT, ubicada en el citosol del parásito, es la segunda enzima limitante de la velocidad de la ruta CDP-etanolamina. Es esencial para la supervivencia del parásito, y su eliminación condicional en el mutante TgECT-AID-3xHA por IAA conduce a una disminución en muchas especies de PtdEtn, PtdSer y PtdThr. Es probable que los dos últimos lípidos estén hechos de PtdEtn a través de las reacciones de intercambio de bases impulsadas por las enzimas PSS y PTS en el ER. La pérdida de ECT afecta el complejo de la membrana interna, que puede ser la base de defectos en la motilidad deslizante, la invasión y la división celular. La necesidad del parásito de PtdEtn enlazado con éter se satisface mediante el rescate de la célula huésped. No está claro si los taquizoítos intracelulares importan éster-PtdEtn derivado de PSD1pv. Las P4-ATPasas que residen en la superficie del parásito pueden desempeñar un papel en la inversión de PtdEtn unida a éter y éster.

Nuestro trabajo sugiere el papel de la vía CDP-etanolamina en la fabricación de éster-PtdEtn. Los niveles de muchas especies de éster-PtdEtn se redujeron en el mutante ECT. Las cantidades imperturbadas y reguladas al alza de otros lípidos específicos indican la presencia funcional y la contribución de rutas adicionales. Ester-PtdEtn puede ser generado por PSD1mt y PSD1pv (Fig. 8)10,21. Además, al menos los taquizoítos extracelulares son capaces de recuperar PtdEtn15,20, y es plausible que, cuando están intracelulares, puedan adquirir PtdEtn derivado de PtdSer producido en la vacuola parasitófora por catálisis de PSD1pv. Finalmente, el retículo endoplásmico del huésped y las mitocondrias reclutadas en la membrana vacuolar son los principales sitios de síntesis de PtdSer y PtdEtn en células de mamíferos y posiblemente sirvan como una fuente adicional de estos lípidos. Curiosamente, los taquizoítos knockout para PSD1mt pueden sobrevivir en cultivos prolongados y mostrar una regulación al alza de la ruta CDP-etanolamina;10 sin embargo, lo contrario parece no ser cierto, ya que la TEC es esencial para el ciclo lítico. Proponemos que distintas reacciones impulsan la síntesis de especies discretas de éster-PtdEtn, y las codificadas por la vía de Kennedy no pueden equilibrarse por otros medios, lo que lleva a un fenotipo letal en el mutante ECT.

La relevancia fisiológica de la vía de Kennedy también se ha estudiado en otros protistas parásitos, incluidos T. brucei y P. bergei37,38. Se informa que las enzimas subyacentes son esenciales para estos parásitos a pesar de que albergan enzimas PSD funcionales. El agotamiento de TbECT perjudicó la proliferación del parásito, lo que se correlacionó con un contenido reducido de PtdEtn y una morfología inusual en T. brucei37. Estos hallazgos reflejan el fenotipo en los taquizoitos de T. gondii empobrecidos en ECT. La pérdida condicional de TgECT anuló la invasión y replicación del parásito, junto con un IMC anormal que puede atribuirse a una composición de fosfolípidos desregulada (posiblemente especies de PtdEtn). Al albergar glideosoma, un complejo motor que impulsa la motilidad del parásito34, el IMC es crucial para el ciclo lítico. Su perturbación tras la pérdida de TgECT puede dar como resultado un glideosoma disfuncional, lo que conduce a una alteración de la motilidad, la invasión y la salida de los taquizoítos. Además, una relación sesgada de éster a PtdEtn unido a éter en el mutante puede afectar la fluidez de la membrana y la citocinesis, como se describe en células de mamíferos23.

Nuestros datos también sugieren que PtdEtn sirve como donante para sintetizar PtdSer y PtdThr a través de una reacción de intercambio de etanolamina a serina o treonina catalizada por proteínas PSS y PTS, respectivamente (Fig. 8). En particular, algunas especies de PtdEtn (36: 1, 38: 4, 40: 4, 40: 5) no se vieron afectadas o incluso aumentaron tras el agotamiento de ECT. Es probable que se produzcan mediante la descarboxilación de PtdSer, lo que amerita un análisis lipidómico de los mutantes PSD1mt y PSD1pv. No se observaron paralelos en la modulación de las especies de PtdCho y PtdIns con la de PtdEtn, lo que repercutió en las rutas independientes de síntesis de los dos primeros fosfolípidos4,5,12. Es importante destacar que este estudio revela el rescate de especies de éter-PtdEtn derivadas del huésped por parásitos intracelulares (Fig. 8). Si bien se sabe que los taquizoítos producen diacilglicerol para producir éster-PtdEtn18, no se pudo encontrar en el genoma del parásito una alquil-glicerona fosfato sintasa de buena fe para producir el andamiaje de alquil-glicerol de éter-PtdEtn. La presencia de lípidos unidos por éter en taquizoítos es enigmática. Se informa que tienen efectos "redox" en células de mamíferos22,24. Ciertas células cultivadas que carecen de ellas se vuelven más sensibles al daño oxidativo. Igualmente, también se ha descrito el carácter prooxidante de estos lípidos39. El trabajo futuro debería centrarse en diseccionar la maquinaria de recuperación y la importancia funcional de los éter-lípidos en los taquizoítos de T. gondii.

En conclusión, este trabajo demuestra que TgECT es una enzima vital que contribuye a la síntesis de éster-PtdEtn. Su agotamiento condicional perjudica la biogénesis de la membrana, la replicación y la invasión en taquizoítos. Revelamos una colaboración de vías endógenas de síntesis, interconversión y recuperación para producir PtdEtn. En particular, los datos muestran una eliminación previamente desconocida de especies de PtdEtn unidas a éter derivadas del huésped por parte del parásito y ofrecen una base sólida para la orientación terapéutica de la síntesis de PtdEtn en T. gondii.

David Sibley (Washington University, St. Louis, EE. EE.UU). Dominique Soldati-Favre (Universidad de Ginebra, Suiza), Sergio O. Angel (IIB-INTECH, Argentina), Marc-Jan Gubbels (Boston College, EE. UU.) ofrecieron otros anticuerpos primarios que se unen a TgGAP45, TgHSP90, TgIMC3 y TgFerredoxin. y Frank Seeber (Instituto Robert-Koch, Berlín), respectivamente. El anticuerpo primario contra TgHSP60 y el suero anti-Tg de cerdo se produjeron en el Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola (Wuhan, China). Se obtuvieron otros anticuerpos primarios contra el epítopo de hemaglutinina (HA) y TgSAG1 de Sigma-Aldrich (Alemania) y ThermoFisher Scientific (Alemania), respectivamente. Los anticuerpos secundarios para la inmunotinción (Alexa488, Alexa594, IRDye 680RD, 800CW) y los oligonucleótidos (Tabla complementaria 1) se adquirieron de Life Technologies (Alemania). Los reactivos de cultivo celular se adquirieron de PAN Biotech (Alemania). Otros productos químicos estándar fueron suministrados por Sigma-Aldrich y Carl Roth (Alemania). Los kits de reactivos para la clonación se adquirieron de Analytik Jena y Life Technologies (Alemania). Los estándares de lípidos fueron proporcionados por Avanti Polar Lipids (EE. UU.).

Se utilizaron fibroblastos de prepucio humano (HFF) como células huésped para propagar taquizoítos de T. gondii. Las células se recogieron mediante tripsinización (0,25 % de tripsina-EDTA) y se sembraron en matraces, platos o cubreobjetos, según los requisitos de los ensayos individuales. Las monocapas confluentes se infectaron en días alternos para mantener los taquizoítos. Los cultivos se realizaron en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) suplementado con glucosa (4,5 g/L), suero fetal bovino (10%, PAN Biotech, Alemania), glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y aminoácidos no esenciales mínimos de Eagle (100 μM cada uno) a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada. Para la mayoría de los ensayos, los taquizoítos se liberaron de cultivos parasitados en etapa tardía raspando y rociando a través de jeringas de calibre 23 y 27. Los parásitos extracelulares se utilizaron directamente para ensayos posteriores.

Se transfectaron taquizoítos (~107) con 10 µg de construcciones de plásmido en cytomix estéril por filtración (KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4/KH2PO4 10 mM, HEPES 25 mM, EGTA 2 mM, MgCl2 5 mM suplementado con glutatión 5 mM fresco y ATP 5 mM, pH 7,6). A continuación, se seleccionaron los parásitos con el fármaco correspondiente al marcador de selección codificado por el plásmido transfectado. Los parásitos transgénicos resistentes a fármacos se clonaron mediante dilución limitante en placas de 96 pocillos que contenían células HFF. Los clones individuales con la manipulación génica deseada se identificaron mediante PCR de cribado y ensayos de inmunotinción. Para generar la cepa TgECT-AID-3xHA, se cotransfectó un amplicón donante que comprende el marcador de selección AID-3xHA-TgGRA1-3′UTR y DHFR-TS flanqueado por brazos homólogos cortos (40 pb) para un cruce en el locus ECT con una construcción CRISPR-Cas9 en la cepa RH∆ku80∆hxgprt-TIR1. Para generar la cepa TgECT-smHA, se transfectó una construcción de plásmido que expresa Cas9 y sgRNA específico de TgECT con un amplicón de PCR que comprende 10xHA y casete de expresión de DHFR-TS en la cepa RHΔku80-hxgprt−. Los parásitos mutantes se seleccionaron mediante pirimetamina 1 µM y se cribaron mediante PCR para el marcado AID-3xHA o smHA de ECT.

El ensayo se ejecutó, como se informó anteriormente41. Las células HFF se sembraron y se cultivaron hasta la confluencia en los cubreobjetos de vidrio colocados en placas de 24 pocillos. Se usaron parásitos recién liberados para infectar monocapas de HFF. Las células huésped parasitadas se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 15 min, seguido de neutralización en glicina 0,1 M/PBS. Las muestras se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,2 %/PBS (20 min) y se bloquearon con BSA al 2 % preparada en Triton-X100 al 0,2 %/PBS (20 min). Finalmente, las células se tiñeron con el primario coincidente (α-HA, 1:3000; α-TgGAP45, 1:5000; α-TgIMC3, 1:2000; α-TgALD, 1:1000; α-TgFerredoxina, 1:500; TgSAG1 , 1:1000; suero porcino anti-Tg, 1:1000, TgMIC2, 1:1000) y anticuerpos secundarios (Alexa488, Alexa594, 1:3000) durante 1 h cada uno. Las muestras se lavaron con PBS entre diferentes pasos de tratamiento y se montaron en DAPI-Fluoromount G para obtener imágenes (Carl-Zeiss, Alemania).

Los ensayos fenotípicos se establecieron con parásitos frescos liberados con jeringa, como se informó anteriormente7,12,32. Brevemente, los ensayos de placas se realizaron en placas de 6 pocillos infectando monocapas de HFF confluentes con 200 parásitos/pocillo, seguido de una incubación sin perturbaciones (-/+ IAA 100 µM en etanol al 0,1 %) durante 7 días. El disolvente portador se incluyó en las muestras no tratadas. Los cultivos se fijaron con metanol frío (15 min) y se tiñeron con cristal violeta (15 min). Las placas se cuantificaron utilizando la suite ImageJ (NIH, Bethesda). Para los ensayos de replicación y endodiogenia, se infectaron las monocapas de HFF confluentes en cubreobjetos (MoI: 1, 24 h, 40 h), seguido de fijación y tinción con anticuerpos α-TgIMC3 y α-TgGAP45. La división celular se evaluó enumerando los parásitos que se replicaban dentro de sus vacuolas parasitóforas. Para determinar la motilidad deslizante, los taquizoítos se precultivaron con IAA durante 48 h (si corresponde). Posteriormente, se sedimentaron (400 g, 5 min, temperatura ambiente) 4 × 105 parásitos suspendidos en solución salina equilibrada de Hank libre de Ca2+ (-/+ IAA), seguido de incubación (15 min, 37 °C) en cubreobjetos recubiertos con 0,01 % ASC. Para visualizar los parásitos y los rastros, las muestras se tiñeron con anticuerpos α-TgSAG1 y Alexa488. Las fracciones móviles se estimaron directamente en el microscopio, mientras que las longitudes de los rastros se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Para la prueba de invasión, los taquizoítos se precultivaron en IAA 100 µM o el solvente portador durante 40 h y luego se usaron para infectar las células huésped en cubreobjetos (MoI: 10, 1 h). Las muestras se fijaron, neutralizaron y tiñeron, como se informó en otra parte32. Los parásitos no invadidos (extracelulares) se inmunoteñeron para TgSAG1 antes de la permeabilización con detergente de los cultivos. Las muestras se lavaron con PBS, se permeabilizaron y se tiñeron para la proteína TgGAP45 para visualizar los taquizoítos (intracelulares) invadidos. Los cultivos se lavaron con PBS, se marcaron con anticuerpos secundarios (Alexa488, Alexa594) y se montaron en DAPI-Fluoromount G para imágenes fluorescentes (Carl-Zeiss, Alemania). El porcentaje de parásitos invadidos (eficiencia de invasión) se contó por parásitos de dos colores. Para los ensayos de salida natural, los HFF cultivados en cubreobjetos se infectaron con parásitos (MoI: 2, 40 h/64 h, −/+ 100 µM IAA), seguido de una tinción en dos pasos (como en el ensayo de invasión) para distinguir el roto y el intacto. vacuolas32.

Un solo experimento de salida natural requería que verificáramos la vacuola del parásito en dos momentos, uno antes de la salida para determinar los PV totales (40 h) y otro después de la salida para calificar los PV restantes (64 h). A las 40 h, los taquizoítos estaban a punto de salir pero no habían salido, mientras que a las 64 h todos los parásitos de las cepas parentales habían salido. La tasa de salida (%) se calculó como [número de PV intactas (40 h) – número de PV intactas (64 h)]/número de PV totales (40 h) × 100. Para la salida inducida, los cultivos parasitados (MoI: 1, 24 h) fueron tratados con zaprinast 500 µM (30 min). Aquí, se eligió un punto de tiempo anterior (24 h de infección, 8-16 parásitos/vacuola) para garantizar que no se produjera ninguna salida en condiciones no inducidas. Para cuantificar la producción de parásitos, las células huésped (106) en placas de cultivo (3 cm) se infectaron con taquizoítos (106 parásitos, MoI: 1) y se contó la progenie después de la liberación de la jeringa (27 G) a las 48 h.

Seleccionamos la infección de 48 h para la recolección de muestras en función del ensayo de rendimiento del parásito. Los lípidos se extrajeron de gránulos frescos de taquizoítos purificados (1 × 107/muestra), como se informó anteriormente7. Los lípidos aislados se secaron bajo una corriente de nitrógeno y se disolvieron en 100 μl de cloroformo y metanol (1:1), 10 μl de los cuales se inyectaron en una columna Acquity BEH C18 UPLC (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) mantenida a 60 °C . La separación de las especies lipídicas se logró con un gradiente de metanol y acetonitrilo en agua, ambos con acetato de amonio 2,5 mM. El gradiente de elución, a un caudal de 600 µL/min, se programó de la siguiente manera (tiempo en min, % B): (0, 12,5), (7,5, 100), (14, 100), (14,1, 87,5) , (17, 87.5). El efluente se sometió a ionización por electropulverización calentada en un instrumento Sciex X500R QToF. Se recogieron espectros de MS2 dependientes de los datos (rango MS1 400-1050 amu; precursor >600 amu; rango MS2 50-1050 amu) con un tiempo de acumulación de 150 ms, energía de colisión de 35 V y una dispersión CE de 15 V. Procesamiento de datos se realizó utilizando el módulo Analytics de SciexOS y MSDial42.

El ensayo se realizó como se describió previamente para [13C6]-mio-inositol12. Para etiquetar parásitos extracelulares con [13C2]-etanolamina (Sigma-Aldrich, Alemania), el mutante TgECT-AID-3xHA se precultivó sin o con IAA 100 μM durante 48 h, seguido de liberación con jeringa, lavado con PBS y filtrado a través de 5 μm filtro para eliminar los residuos. Luego, los parásitos (1 × 107) se suspendieron en 100 μL de DMEM (-/+ IAA) que contenía [13C2]-etanolamina 0,5 mM y se incubaron a 37 °C durante 6 h antes del análisis lipidómico. Para el marcaje intracelular de parásitos en HFF que albergan [13C2]-PtdEtn, se cultivaron células huésped en matraces T-175 hasta la confluencia en [13C2]-etanolamina 25 μM. Los cultivos se lavaron con PBS para eliminar el exceso de isótopo del medio y se infectaron con parásitos en presencia de un exceso de 50x (1,25 mM) de etanolamina para evitar la inclusión del isótopo acumulado intracelularmente en la PtdEtn producida endógenamente de los taquizoítos proliferantes. Los parásitos de la progenie se analizaron para las especies PtdEtn unidas a éster y éter.

Las monocapas de HFF en matraces T75 se infectaron con taquizoítos (MoI = 2) durante 48 h. Las células parasitadas se rasparon, se lavaron con PBS y se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2,5 % (v/v)/PBS (0,1 M, pH 7,2) a 4 °C. Las muestras se lavaron con PBS (3x, 30 min a temperatura ambiente), se posfijaron en tetróxido de osmio al 1 % (p/v) durante 2 h, se volvieron a lavar con PBS durante 30 min y se deshidrataron en una serie graduada de concentraciones de acetona. Los bloques deshidratados se infiltraron progresivamente y se incluyeron en resina Spurr (SPI Chem, EE. UU.), y luego se polimerizaron a 65 °C durante 48 h. Las muestras se cortaron en secciones ultrafinas (de 60 a 70 nm de espesor) con un cuchillo de diamante, se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % y se tomaron imágenes a 80 kV con un microscopio electrónico de transmisión (H-7650, Hitachi, Japón).

A menos que se especifique lo contrario, los datos que se muestran en los gráficos se presentan como la media con SE de tres experimentos que utilizan clones de parásitos representativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism (CA, EE. UU.). La significación se probó mediante la prueba t de dos colas no pareadas con la misma varianza (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001). Introdujimos la tasa de descubrimiento falso para las pruebas de comparación múltiple.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados y/o analizados durante este estudio se proporcionan en el documento principal (Figs. 1–8) y archivos complementarios (Suplementarios Figs. 1–6, Tabla 1). Las imágenes originales de gel, transferencia y placa se muestran en la Fig. 6 complementaria. Los datos de origen para los gráficos y las imágenes se pueden encontrar en los archivos de Excel complementarios (Datos complementarios 1–2). Todos los recursos también están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.

Dubey, JP, Lindsay, DS y Speer, CA Estructuras de taquizoítos, bradizoítos y esporozoítos de Toxoplasma gondii y biología y desarrollo de quistes tisulares. clin. Microbiol. Rev. 11, 267–299 (1998).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blader, IJ, Coleman, BI, Chen, CT y Gubbels, MJ Ciclo lítico de Toxoplasma gondii: 15 años después. año Rev. Microbiol. 69, 463–485 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramakrishnan, S., Serricchio, M., Striepen, B. & Butikofer, P. Síntesis de lípidos en parásitos protozoarios: una comparación entre cinetoplástidos y apicomplejos. prog. Res. de lípidos 52, 488–512 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kong, P., Lehmann, MJ, Helms, JB, Brouwers, JF y Gupta, N. El análisis de lípidos de los esporozoitos de Eimeria revela fosfolípidos exclusivos, un mosaico filogenético de síntesis endógena y un estilo de vida independiente del huésped. Discoteca Celda. 4, 24 (2018).

Artículo Google Académico

Gupta, N., Zahn, MM, Coppens, I., Joiner, KA y Voelker, DR La interrupción selectiva del metabolismo de la fosfatidilcolina del parásito intracelular Toxoplasma gondii detiene su crecimiento. J. Biol. química 280, 16345–16353 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Welti, R. et al. El análisis lipidómico de Toxoplasma gondii revela lípidos polares inusuales. Bioquímica 46, 13882–13890 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Arroyo-Olarte, RD et al. Fosfatidiltreonina y control de la virulencia del parásito mediado por lípidos. PLoS Biol. 13, e1002288 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

van Meer, G., Voelker, DR & Feigenson, GW Lípidos de membrana: dónde están y cómo se comportan. Nat. Rev Mol. Biol celular. 9, 112–124 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sampels, V. et al. La mutagénesis condicional de una nueva colina quinasa demuestra la plasticidad de la biogénesis de la fosfatidilcolina y la expresión génica en Toxoplasma gondii. J. Biol. química 287, 16289–16299 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hartmann, A., Hellmund, M., Lucius, R., Voelker, DR y Gupta, N. La síntesis de fosfatidiletanolamina en la mitocondria del parásito es necesaria para un crecimiento eficiente, pero prescindible para la supervivencia de Toxoplasma gondii. J. Biol. química 289, 6809–6824 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kong, P. et al. Dos CDP-diacilglicerol sintasas filogenéticamente y compartimentalmente distintas cooperan para la biogénesis de lípidos en Toxoplasma gondii. J. Biol. química 292, 7145–7159 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren, B., Kong, P., Hedar, F., Brouwers, JF y Gupta, N. Síntesis de fosfatidilinositol, su rescate selectivo e interregulación de fosfolípidos aniónicos en Toxoplasma gondii. común Biol. 3, 750 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bullen, HE et al. La señalización mediada por ácido fosfatídico regula la secreción de micronemas en toxoplasma. Microbio huésped celular 19, 349–360 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kuchipudi, A., Arroyo-Olarte, RD, Hoffmann, F., Brinkmann, V. & Gupta, N. El monitoreo optogenético identifica la homeostasis del calcio regulada por fosfatidiltreonina en Toxoplasma gondii. Micro. Celda 3, 215–223 (2016).

Artículo Google Académico

Bisio, H., Krishnan, A., Marq, JB y Soldati-Favre, D. El complejo ATP2B-CDC50.4 de fosfatidilserina flipasa de Toxoplasma gondii participa críticamente en la exocitosis de micronemas. Patog de PLoS. 18, e1010438, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010438 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nitzsche, R., Gunay-Esiyok, O., Tischer, M., Zagoriy, V. y Gupta, N. Una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa de tipo vegetal/fúngico ubicada en la mitocondria del parásito asegura la supervivencia independiente de la glucosa de Toxoplasma gondii. J. Biol. química 292, 15225–15239 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amiar, S. et al. El ensamblaje de precursores de ácido lisofosfatídico localizado en apicoplasto es necesario para la síntesis de fosfolípidos a granel en Toxoplasma gondii y se basa en una glicerol 3-fosfato aciltransferasa similar a algas/plantas. Patog de PLoS. 12, e1005765 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dass, S. et al. Toxoplasma LIPIN es esencial para canalizar los flujos de lípidos del huésped a través de la biogénesis de la membrana y el almacenamiento de lípidos. Nat. común 12, 2813 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shunmugam, S., Arnold, CS, Dass, S., Katris, NJ y Botte, CY La flexibilidad de los parásitos Apicomplexa en el metabolismo de los lípidos. Patog de PLoS. 18, e1010313 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, K. et al. Flipping de aminoglicerofosfolípidos y P4-ATPasas en Toxoplasma gondii. J. Biol. química 296, 100315 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gupta, N., Hartmann, A., Lucius, R. & Voelker, DR El parásito intracelular obligado Toxoplasma gondii secreta una fosfatidilserina descarboxilasa soluble. J. Biol. química 287, 22938–22947 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dean, JM & Lodhi, IJ Funciones estructurales y funcionales de los lípidos de éter. Protein Cell 9, 196–206 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Emoto, K. & Umeda, M. Un papel esencial para un lípido de membrana en la citocinesis. Regulación del desmontaje del anillo contráctil por redistribución de fosfatidiletanolamina. J. Cell Biol. 149, 1215–1224 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jimenez-Rojo, N. & Riezman, H. En el camino para desentrañar las funciones moleculares de los lípidos de éter. FEBS Lett. 593, 2378–2389 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gibellini, F. & Smith, TK La vía de Kennedy: síntesis de novo de fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina. IUBMB Life 62, 414–428 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Maheshwari, S. et al. La caracterización bioquímica de Plasmodium falciparum CTP:fosfoetanolamina citidililtransferasa muestra que solo uno de los dos dominios de citidililtransferasa está activo. Bioquímica J. 450, 159–167 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tian, ​​S. et al. CTP humana: fosfoetanolamina citidililtransferasa: propiedades enzimáticas y funciones catalíticas desiguales de los motivos de unión a CTP en dos dominios de citidililtransferasa. Bioquímica Biografía. Res. común 449, 26–31 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shen, B. & Sibley, LD La aldolasa de toxoplasma es necesaria para el metabolismo pero prescindible para la invasión de células huésped. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 111, 3567–3572 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Starnes, GL, Jewett, TJ, Carruthers, VB y Sibley, LD Se requieren dos dominios de aminoácidos ácidos conservados separados dentro de la cola citoplásmica MIC2 de Toxoplasma gondii para la supervivencia del parásito. J. Biol. química 281, 30745–30754 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Brown, KM, Long, S. & Sibley, LD Eliminación condicional de proteínas usando fusiones de Degron inducible por auxina (AID) en Toxoplasma gondii. biografía Protocolo 8, https://doi.org/10.21769/BioProtoc.2728 (2018).

Echeverría, PC et al. Toxoplasma gondii Hsp90 es un posible objetivo farmacológico cuya expresión y localización subcelular están reguladas por el desarrollo. J. Mol. Biol. 350, 723–734 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gunay-Esiyok, O., Scheib, U., Noll, M. & Gupta, N. Una proteína inusual y vital con dominios de guanilato ciclasa y P4-ATPasa en un protista patógeno. Life Sci Alliance 2, https://doi.org/10.26508/lsa.201900402 (2019).

Howard, BL et al. Identificación de potentes inhibidores de la fosfodiesterasa que demuestran funciones dependientes de nucleótidos cíclicos en parásitos apicomplejos. ACS química. Biol. 10, 1145–1154 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Frenal, K. et al. Disección funcional de la arquitectura molecular del glideosoma apicomplejo. Microbio huésped celular 8, 343–357 (2010).

Artículo PubMed Google Académico

Plattner, F. et al. La profilina de toxoplasma es esencial para la invasión de la célula huésped y la inducción de una respuesta de interleucina-12 dependiente de TLR11. Cell Host Microbe 3, 77–87 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gubbels, MJ, Wieffer, M. & Striepen, B. Marcado de proteínas fluorescentes en Toxoplasma gondii: identificación de un nuevo componente complejo de membrana interna conservado entre Apicomplexa. mol. Bioquímica Parasitol. 137, 99–110 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gibellini, F., Hunter, WN & Smith, TK La rama de la etanolamina de la vía de Kennedy es esencial en la forma del torrente sanguíneo de Trypanosoma brucei. mol. Microbiol. 73, 826–843 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dechamps, S. et al. Las vías de biosíntesis de fosfolípidos de Kennedy son refractarias a la alteración genética en Plasmodium berghei y, por lo tanto, parecen esenciales en los estadios sanguíneos. mol. Bioquímica Parasitol. 173, 69–80 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zoeller, RA, Morand, OH & Raetz, CR Una posible función de los plasmalógenos en la protección de las células animales contra la muerte fotosensibilizada. J. Biol. química 263, 11590–11596 (1988).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hortúa Triana, MA et al. Etiquetado de genes relacionados con el calcio de Toxoplasma gondii débilmente expresados ​​con etiquetas de alta afinidad. J. Eucariota. Microbiol. 65, 709–721 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blume, M. et al. La glucosa derivada del huésped y su transportador en el patógeno intracelular obligado Toxoplasma gondii son prescindibles por glutaminólisis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 12998–13003 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsugawa, H. et al. Un atlas de lipidomas en MS-DIAL 4. Nat. Biotecnología. 38, 1159–1163 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Grit Meusel (Universidad Humboldt, Berlín) por la asistencia técnica y a Limin He (Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan) por apoyar el trabajo de microscopía electrónica. También estamos agradecidos con la comunidad de Toxoplasma por compartir los recursos indicados. Este trabajo fue patrocinado principalmente por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través del programa Heisenberg (GU1100/16) y la subvención del proyecto (GU1100/17) otorgada a Nishith Gupta. Bang Shen recibió fondos adicionales de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, 31961133032, co-PI: Nishith Gupta) y Nishith Gupta de DBT–Wellcome Trust (India Alliance, IA/S/19/1/504263) . También reconocemos la financiación de DFG para iniciar la cooperación internacional (GU1100/15), apoyando una visita a corto plazo de Bang Shen a Gupta Labs. La investigación colaborativa de Xiaohan Liang en la Universidad Humboldt de Berlín fue patrocinada por un programa de movilidad académica (M0074) otorgado a Nishith Gupta y Bang Shen por el Centro Sino-Alemán para la Promoción de la Investigación (CDZ). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño, la recopilación de datos, el análisis, la preparación o la decisión de publicar este trabajo. Los datos de esta publicación se generaron principalmente en la Universidad Humboldt de Berlín (HUB). Se agradece el apoyo de HUB Open Access Publication Fund para sufragar el costo de este artículo.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bingjian Ren, Xiaohan Liang.

Departamento de Parasitología Molecular, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Humboldt, Berlín, Alemania

Bingjian Ren y Nishith Gupta

Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan, China

Xiaohan Liang, Bang Shen y Nishith Gupta

Grupo de Investigación de Técnicas de Análisis en Ciencias de la Vida, Facultad de Ciencias y Tecnología de la Vida, Universidad de Ciencias Aplicadas de Avans, Breda, Países Bajos

José F. Brouwers

Laboratorios de Investigación y Educación sobre Parásitos Intracelulares (iPEARL), Departamento de Ciencias Biológicas, Instituto Birla de Tecnología y Ciencia, Pilani (BITS-P), Hyderabad, India

Salvamos a Cross Miron y Nishith Gupta

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

NG conceptualizó y supervisó el proyecto; BR, XL y RCM realizaron experimentos; BR, XL y NG analizaron los datos y redactaron el documento; JB realizó el análisis lipidómico; NG y BS adquirieron y gestionaron la financiación. Todos los autores revisaron, editaron y aprobaron el artículo.

Correspondencia a Bang Shen o Nishith Gupta.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. NG es miembro del consejo editorial de la revista Communications Biology, pero no participó en la revisión editorial ni en la decisión de publicar este artículo.

Communications Biology agradece a Hayley (E) Bullen y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ren, B., Liang, X., Brouwers, JF et al. Síntesis frente a recuperación de fosfatidiletanolamina unida a éster y éter en el patógeno protozoario intracelular Toxoplasma gondii. Comun Biol 6, 306 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

Descargar cita

Recibido: 25 Septiembre 2022

Aceptado: 06 marzo 2023

Publicado: 22 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.