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May 29, 2023

Omega

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3013 (2022) Citar este artículo

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La hipertensión pulmonar es una enfermedad rara fatal que causa insuficiencia cardiaca derecha por resistencia arterial pulmonar elevada. Existe una necesidad médica no satisfecha para el desarrollo de tratamientos centrados en la remodelación vascular pulmonar. Los lípidos bioactivos producidos por las células inflamatorias perivasculares podrían modular la remodelación vascular. Aquí, mostramos que los epóxidos derivados de ácidos grasos ω-3 (epóxidos ω-3) liberados de los mastocitos por PAF-AH2, una fosfolipasa A2 selectiva de fosfolípidos oxidada, regulan negativamente la hipertensión pulmonar. La eliminación genética de Pafah2 en ratones acelera la remodelación vascular, lo que resulta en una exacerbación de la hipertensión pulmonar hipóxica. El tratamiento con epóxidos ω-3 suprime la activación de fibroblastos pulmonares al inhibir la señalización de TGF-β. La suplementación con epóxidos ω-3 in vivo atenúa la progresión de la hipertensión pulmonar en varios modelos animales. Además, la secuenciación del exoma completo para pacientes con hipertensión arterial pulmonar identifica dos variantes patogénicas candidatas de Pafah2. Nuestros hallazgos respaldan que el eje de producción de epóxido PAF-AH2-ω-3 podría ser un objetivo terapéutico prometedor para la hipertensión pulmonar.

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad rara y fatal que causa estenosis idiopática de la arteria pulmonar, lo que conduce a un aumento de la presión de la arteria pulmonar y esta sobrecarga de presión crónica eventualmente resulta en insuficiencia cardíaca derecha y muerte. La hipertensión pulmonar (HP) se caracteriza por cambios tisulares irreversibles, conocidos como "remodelación vascular pulmonar", que involucran las células endoteliales de la arteria pulmonar, las células del músculo liso y los fibroblastos1,2. Aunque las terapias disponibles para la HP han mejorado notablemente la supervivencia de los pacientes con HAP3, una parte importante de los pacientes no alcanza la eficacia esperada. Por lo tanto, los medicamentos que pueden suprimir la remodelación vascular pulmonar y reducir la progresión de la enfermedad se consideran una necesidad médica insatisfecha que potencialmente puede aumentar la supervivencia del paciente4.

Las células inflamatorias juegan un papel importante en la remodelación de los tejidos. En el remodelado vascular pulmonar, varios tipos de células inflamatorias presentes en el tejido pulmonar producen factores humorales, como citocinas y quimiocinas, que controlan las alteraciones del tejido vascular1,2,5. Además, las células inflamatorias locales también producen mediadores lipídicos y estos mediadores regulan la inflamación, la formación de trombos, la angiogénesis y la fibrosis, todo lo cual puede acelerar la remodelación vascular6,7. De hecho, se ha demostrado que los lípidos funcionales proinflamatorios, como los prostanoides y los leucotrienos, contribuyen a la patogenia de la HP8,9,10. Por otro lado, se sabe que los ácidos grasos ω-3, principalmente el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA), desempeñan un papel bioprotector, y se ha informado que algunos de sus derivados poseen funciones únicas, que pueden suprimir la remodelación de los tejidos6 ,11,12,13. Usando un modelo de remodelación cardíaca inducida por sobrecarga de presión, nuestro informe anterior demostró que los metabolitos de EPA liberados por los macrófagos suprimieron la activación anormal de los fibroblastos cardíacos y mantuvieron la homeostasis tisular14. Por lo tanto, también se espera que los ácidos grasos ω-3 y sus derivados supriman la remodelación vascular pulmonar en la HP, pero esto aún está por determinarse.

Aquí, mediante un análisis lipidómico integral de muestras de pulmón con PH y un análisis fenotípico de ratones knock-out (KO) del factor activador de plaquetas acetilhidrolasa tipo II (PAF-AH2), una enzima productora de epóxido ω-3 a partir de fosfolípidos de membrana, revelamos que los ácidos grasos ω-3 epoxidados tienen un éter de anillo de 3 miembros (epóxidos ω-3; 17,18-EpETE y 19,20-EpDPE) como mediadores lipídicos funcionales involucrados en la patogénesis de la HP. Los epóxidos omega-3 se producían constantemente a partir de los mastocitos en el pulmón para suprimir la activación anormal de los fibroblastos adventiciales y mostraban efectos terapéuticos sobre la HP incluso cuando se administraban externamente. También encontramos mutaciones patógenas de PAF-AH2 en pacientes con PAH que no respondían lo suficiente a las terapias actuales, lo que sugiere que el epóxido ω-3 podría ser un objetivo terapéutico valioso para la PAH.

Para identificar los lípidos funcionales valiosos que estaban característicamente alterados en los pulmones con PH, realizamos un análisis lipidómico completo mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS) para determinar los metabolitos de EPA, DHA y ácido araquidónico (AA) en los tejidos pulmonares de ratones con HP inducida por hipoxia crónica (concentración de oxígeno al 10%). Encontramos que los niveles de epóxidos ω-3, 17,18-EpETE y 19,20-EpDPE, y sus dihidrodioles inactivos, 17,18-diHETE y 19,20-diHDoPE, se redujeron en tejidos de pulmones hipóxicos (Fig. 1a–c, Fig. complementaria 1a–e). De acuerdo con estos resultados, la expresión de PAF-AH2, una enzima clave que pertenece a la familia de las fosfolipasas A2 y que hidroliza preferentemente los fosfolípidos de membrana que contienen epóxido ω-3 para liberar epóxidos ω-315, también se redujo significativamente en los tejidos de los pulmones hipóxicos ( Figura 2a).

a, b Metabolitos de ácidos grasos omega-3 en lipidómica basada en LC-MS/MS de los pulmones de ratones WT expuestos a normoxia o hipoxia (10 % de O2) durante 4, 14 y 28 días. a Metabolitos de EPA, b Metabolitos de DHA. El puntaje Z se calculó a partir del valor promedio de cada grupo (n = 3) y se mostró como un mapa de calor. c Los contenidos de epóxidos ω-3 (17,18-EpETE y 19,20-EpDPE) y sus dihidrodioles (17,18-diHETE y 19,20-diHDoPE) evaluados por LC-MS/MS basada en lipidómica de pulmones de Ratones WT sometidos a normoxia o hipoxia durante 4, 14 y 28 días (n = 3). Los datos son la media ± SEM. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett.

una transferencia Western de PAF-AH2 en proteína total de los pulmones de ratones WT y ratones Pafah2 KO expuestos a normoxia o hipoxia durante 8 semanas (izquierda) y cuantificación por densitometría (derecha). Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se agruparon. b Los contenidos de epóxidos ω-3 evaluados mediante lipidómica basada en LC-MS/MS de los pulmones en ratones WT y ratones Pafah2 KO expuestos a hipoxia durante 8 semanas (n = 4,5). c Imagen representativa de secciones histológicas con tinción HE (arriba) y tinción EVG (abajo) de pulmones en ratones WT, Pafah2 KO y Pla2g7 KO expuestos a normoxia o hipoxia durante 8 semanas. Barra de escala, 50 μm. d–f La evaluación de la gravedad de la PH en ratones WT, Pafah2 KO y Pla2g7 KO expuestos a normoxia o hipoxia durante 8 semanas (normoxia, n = 4,4,4; hipoxia, n = 6,8,6). Espesor de la pared de las arteriolas pulmonares (d), RVSP (e), proporción de peso de RV a LV + tabique (f). Los experimentos se repitieron dos veces y los datos se agruparon (e, f). g Niveles relativos de ARNm de Nppa en RV de ratones WT expuestos a hipoxia y ratones Pafah2 KO (n = 6, 8). Los niveles de expresión se normalizaron a los del ARN ribosomal 18S y luego a los del RV de ratones WT. h Curvas de Kaplan-Meier de ratones WT, Pafah2 KO y Pla2g7 KO expuestos a hipoxia hasta 100 días (n = 16). Prueba de rango logarítmico; WT frente a Pafah2 KO, P = 0,002, Pafah2 KO frente a Pla2g7 KO, P = 0,011. Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se agruparon. i Niveles relativos de ARNm de Col1a1 en pulmones de ratones WT y ratones Pafah2 KO expuestos a normoxia o hipoxia durante 8 semanas (n = 6). Los niveles de expresión se normalizaron a los del ARN ribosomal 18S y luego a los del pulmón de ratones WT. j Imagen representativa de inmunohistoquímica para vimentina y CD31 en pulmones de ratones WT y ratones Pafah2 KO expuestos a hipoxia durante 8 semanas. Los núcleos se marcaron con DAPI. Barra de escala, 50 μm. Los datos son la media ± SEM. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA bidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni (a), ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey (d–f) o la prueba T de Student de 2 colas (b, g, i).

Para determinar la importancia de los epóxidos ω-3 en el desarrollo de HP, investigamos el fenotipo de ratones deficientes en PAF-AH2 sometidos a hipoxia crónica (8 semanas). Los ratones Pafah2 KO produjeron cantidades más bajas de epóxidos ω-3, especialmente 17,18-EpETE y 19, 20-EpDPE, en sus pulmones en condiciones hipóxicas, en comparación con los ratones de tipo salvaje (WT) (Fig. 2b, Suplementario Fig. 2a ). El análisis histológico reveló que los ratones Pafah2 KO con HP mostraron una remodelación vascular pulmonar avanzada, como engrosamiento de la pared de la arteria pulmonar y fibrosis perivascular grave (Fig. 2c, d). De acuerdo con estos hallazgos, los ratones Pafah2 KO tenían una presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) más alta durante el examen de catéter cardíaco que los ratones WT, lo que indica una mayor gravedad de la HP (Fig. 2e). Además, los ratones Pafah2 KO con HP hipóxica exhibieron insuficiencia cardíaca derecha avanzada, como hipertrofia ventricular derecha (RV) aumentada (Fig. 2f) y niveles más altos de ARNm de Nppa, un marcador de insuficiencia cardíaca, en el RV (Fig. 2g), lo que resultó en una alta tasa de mortalidad de casi el 80% en 100 días después de la exposición hipóxica (Fig. 2h). Aunque evaluamos los impactos del sexo en el modelo de ratón con PH, no se observaron diferencias en la gravedad de la PH hipóxica y en el fenotipo de la PH exacerbada en ratones Pafah2 KO (Fig. 3a-d complementaria). La remodelación vascular pulmonar inducida por hipoxia de los ratones Pafah2 KO se caracterizó por una fibrosis perivascular grave, como lo indican los niveles más altos de ARNm de Col1a1, así como las áreas positivas para vimentina en los vasos pulmonares (Fig. 2i, j). Además, evaluamos el fenotipo de PH utilizando ratones tipo plasma PAF-AH KO (Pla2g7 KO), una enzima que tiene una actividad enzimática de PAF-acetil hidrolasa similar a la de PAF-AH216,17, pero no se observaron alteraciones severas en el PH. observado (Fig. 2c-f, h). Estos hallazgos sugieren que los metabolitos lipídicos exclusivos de PAF-AH2, por ejemplo, los epóxidos ω-3, desempeñan un papel importante en la progresión de la HP.

A continuación, identificamos el tipo de células responsables de producir epóxidos ω-3 en los pulmones. La inmunohistoquímica fluorescente de muestras de pulmón del modelo de ratón con PH hipóxico, el modelo de ratón con PH Sugen/hipoxia y pacientes con HAP idiopática humana reveló que las células que expresaban PAF-AH2 eran mastocitos positivos para triptasa, pero no macrófagos, fibroblastos, células endoteliales y células respiratorias. células epiteliales (Fig. 3a, Fig. Suplementaria 4a, b). De acuerdo con los hallazgos de informes anteriores18,19, se encontró que los mastocitos se acumulaban alrededor de los vasos pulmonares en los pulmones con PH (Fig. 3b).

una imagen representativa de inmunotinción de PAF-AH2, triptasa y CD31 en pulmón de ratones PH o pacientes con PAH. SuHx; Sugen/hipoxia. Barra de escala, 50 μm. b Imagen representativa de la tinción con azul de toluidina de secciones de pulmón en ratones PH, ratas PH o pacientes con PAH. Las flechas indican mastocitos positivos para azul de toluidina. V lumen vascular, MCT Monocrotalina. Barra de escala, 50 μm. c Diagrama esquemático de ratones Kit W-sh/W-sh reconstituidos con BMMC sometidos a PH. Cateterismo cardíaco derecho del RHC. d Imagen representativa de la tinción EVG de las arteriolas pulmonares en ratones Kit W-sh/W-sh reconstituidos con BMMC WT (WT → W-sh) o BMMC Pafah2 KO (Pafah2 KO → W-sh) después de 4 semanas de exposición hipóxica. Barra de escala, 50 μm. e – g La evaluación de la gravedad del PH de ratones Kit W-sh/W-sh reconstituidos con BMMC expuestos a hipoxia (n = 5,7). Espesor de la pared de las arteriolas pulmonares (e), RVSP (f), proporción de peso de RV a LV + tabique (g). Los experimentos se repitieron dos veces y los datos se agruparon (f, g). Niveles relativos de ARNm de Nppa en RV (h) y Col1a1 en pulmones (i) de ratones Kit W-sh/W-sh reconstituidos con BMMC expuestos a hipoxia. (n = 4,5). Los niveles de expresión se normalizaron a los del ARN ribosomal 18S y luego a los del RV o pulmón de ratones WT → W-sh. Los datos son la media ± SEM. Los valores de P se determinaron mediante la prueba T de Student de 2 colas.

Para determinar si los mastocitos que expresan PAF-AH2 contribuyeron al fenotipo de HP grave observado en ratones Pafah2 KO, preparamos ratones deficientes en mastocitos (Kit W-sh/W-sh) y los reconstituimos con mastocitos derivados de médula ósea (BMMC). ) de ratones WT o ratones Pafah2 KO. Luego expusimos a estos ratones a hipoxia durante 4 semanas (Fig. 3c). A las 4 semanas después de la inyección de BMMC, se pudo confirmar una cantidad suficiente de mastocitos positivos para triptasa y positivos para PAF-AH2 en los pulmones de los ratones reconstituidos (Figuras complementarias 4c, d). Como era de esperar, los ratones Kit W-sh/W-sh reconstituidos con Pafah2 KO BMMC exhibieron un fenotipo de PH grave en comparación con los reconstituidos con WT BMMC (Fig. 3d-i), lo que sugiere que la falta de actividad de PAF-AH2 en el mástil células fue responsable del fenotipo de los ratones Pafah2 KO en condiciones hipóxicas.

Se sabe que los epóxidos omega-3 promueven la desgranulación dependiente de IgE en los mastocitos15. Investigamos si la desgranulación de mastocitos inducida por hipoxia se vio afectada por la presencia o ausencia de PAF-AH2 in vivo. Si bien la hipoxia aumentó los mastocitos en los pulmones y aumentó ligeramente su desgranulación, el número total y la tasa de desgranulación de los mastocitos en los pulmones no mostraron diferencias significativas entre los ratones WT y los ratones Pafah2 KO en normoxia o hipoxia (Fig. 5a, b). Además, la desgranulación de las BMMC dependiente de la hipoxia evaluada mediante la liberación de β-HEX in vitro fue casi comparable entre las BMMC WT y las BMMC Pafah2 KO (Fig. 5c complementaria).

Con el fin de investigar si la desgranulación de los mastocitos mediaba la exacerbación de la HP hipóxica en ausencia de PAF-AH2 in vivo, evaluamos la mejora de la HP hipóxica en ratones Pafah2 KO cuando se les administró ketotifeno, un estabilizador de mastocitos que inhibe su desgranulación. . Aunque el ketotifeno suprimió significativamente la desgranulación de los mastocitos dependiente de la hipoxia en los pulmones (Fig. 5d complementaria), los ratones Pafah2 KO exhibieron HP severa independientemente del tratamiento con ketotifeno (Fig. 5e-g complementaria), lo que indica que la desgranulación de los mastocitos fue no está involucrado en el mecanismo subyacente a la HP severa inducida por la ausencia de PAF-AH2.

Dado que los mastocitos secretan epóxidos ω-3 incluso en condiciones de reposo, independientemente de la estimulación del antígeno IgE15, planteamos la hipótesis de que los epóxidos ω-3 de los mastocitos actuaron y controlaron las células constitutivas de la arteria pulmonar de manera paracrina, especialmente los fibroblastos perivasculares. que se activaron significativamente en ratones Pafah2 KO expuestos a hipoxia (Fig. 2i, j). Para examinar el impacto de los lípidos liberados por los mastocitos en los fibroblastos pulmonares, agregamos extractos de lípidos de la fracción de ácidos grasos libres aislada de los sobrenadantes de cultivo de BMMC a fibroblastos pulmonares murinos de cultivo primario. Los extractos de lípidos de las BMMC Pafah2 KO aumentaron la proliferación de fibroblastos y las expresiones de ARNm de los marcadores de activación de fibroblastos, incluidos Col1a1 y Acta2, en comparación con los sobrenadantes de las BMMC WT. El tratamiento aditivo con epóxidos ω-3 suprimió la proliferación aberrante y la regulación positiva de los genes marcadores de activación en los fibroblastos estimulados con extractos de lípidos de los BMMC Pafah2 KO (Fig. 4a, Fig. 6a complementaria). La proliferación de fibroblastos pulmonares se suprimió mediante el tratamiento con epóxidos ω-3, 17,18-EpETE o 19,20-EpDPE, pero no con EPA, DHA o sus dihidrodioles (Fig. 4b, Fig. 6b complementaria). Centrándonos en la señalización de TGF-β, que está estrechamente relacionada con la fibrosis tisular y la fisiopatología de PAH1,20, evaluamos la eficacia de los epóxidos ω-3 en los fibroblastos pulmonares. El tratamiento con epóxidos ω-3 suprimió significativamente la expresión de ARNm de Col1a1, Acta2 e Il6 (Fig. 4c) y la expresión de SM22α, un marcador de miofibroblastos, en los fibroblastos de pulmón en condiciones estimuladas con TGF-β (Fig. 4d) , lo que indica que los epóxidos ω-3 suprimieron la activación de los fibroblastos. Además, los epóxidos ω-3 también exhibieron un efecto inhibidor sobre la migración de fibroblastos pulmonares (Fig. 6c complementaria). El otro ácido graso epoxidado, un epóxido ω-6 que incluye 14,15-EET, no mostró los efectos inhibidores sobre los fibroblastos de pulmón activados por TGF-β (Figuras complementarias 7a, b). Se confirmó que los epóxidos ω-3 inhibían la fosforilación de Smad2, un sustrato aguas arriba de la vía de señalización de TGF-β, lo que sugiere que esta vía es uno de los mecanismos de acción (Fig. 4e).

a Número relativo de fibroblastos de pulmón estimulados por extractos de lípidos de medio de cultivo de BMMC cuando se tratan con o sin epóxidos ω-3 (1 μM) durante 48 h (n = 4). Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales independientes. b Número relativo de fibroblastos pulmonares tratados con vehículo, 17,18-EpETE (1 μM), 17,18-diHETE (1 μM), 19,20-EpDPE (1 μM), 19,20-diHDoPE (1 μM), EPA (1 μM) o DHA (1 μM) durante 48 h (n = 4). Los datos son representativos de 3 réplicas experimentales independientes. c Niveles de expresión relativos de ARNm de Col1a1, Acta2 e Il6 en fibroblastos de pulmón tratados con vehículo, 17,18-EpETE (1 μM) o 19,20-EpDPE (1 μM) durante 6 h cuando se estimulan con o sin TGF-β (2,5 ng/ml) (n = 4). Los niveles de expresión se normalizaron a los del ARN ribosomal 18S y luego a los de los fibroblastos de control no estimulados. Los datos son representativos de 3 réplicas experimentales independientes. d Inmunotinción de SM22α en fibroblastos de pulmón tratados con vehículo, 17,18-EpETE (1 μM), 19,20-EpDPE (1 μM), EPA (1 μM) o DHA (1 μM) durante 24 h cuando se estimulan con o sin TGF-β (2,5 ng/ml) (izquierda). Barra de escala, 50 μm. Proporción de células positivas para SM22α a fibroblastos pulmonares totales (derecha) (n = 4). Los datos son representativos de 2 réplicas experimentales independientes. e Transferencia de Western de pSmad2, Smad2 y β-actina en extractos de proteína total de fibroblastos de pulmón cuando se administra vehículo, 17,18-EpETE (1 μM) o 19,20-EpDPE (1 μM) con o sin estimulación con TGF-β (1 ng/ml y 2,5 ng/ml) durante 15 min (izquierda) y cuantificación por densitometría (derecha). Los experimentos se repitieron tres veces y los datos se agruparon. Los datos son la media ± SEM. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett (a–d) o ANOVA bidireccional con la prueba post hoc de Tukey (e).

Estudios previos han demostrado que anomalías en las células endoteliales y del músculo liso de la arteria pulmonar están significativamente implicadas en la patogenia de la HAP1,2. Sin embargo, los epóxidos ω-3 no afectaron la expresión génica asociada con la fisiopatología de la PAH en las células endoteliales de la arteria pulmonar (Fig. 8a complementaria) y no ejercieron efectos antioxidantes en las células endoteliales para proteger contra las lesiones oxidativas (Fig. 8b complementaria, c ). Además, la proliferación de las células del músculo liso de la arteria pulmonar no se vio afectada por el tratamiento con extractos de lípidos de BMMC (Fig. 8d complementaria) o con epóxidos ω-3 (Fig. 8e complementaria).

También evaluamos un mecanismo que regula la expresión de PAF-AH2 en mastocitos. Como se ve en pulmones hipóxicos in vivo (Fig. 2a), la expresión de Pafah2 también se reguló a la baja en BMMC cuando se cultivó bajo hipoxia in vitro (Fig. 9a complementaria), mientras que la expresión de Cyp4a12, una enzima responsable de la epoxidación ω-321, en BMMC permaneció sin cambios (Fig. 9a complementaria). Cuando se administró con dimetiloxalilglicina (DMOG) o CoCl2, activadores del factor inducible por hipoxia (HIF), la expresión de Pafah2 se redujo en BMMC (Fig. 9b complementaria), lo que sugiere que PAF-AH2 estaba regulado por HIF.

Validamos el potencial terapéutico de los epóxidos ω-3 para la HAP. En los modelos de ratón con hipoxia crónica PH, se administró 19,20-EpDPE dos semanas después de la exposición hipóxica a una dosis de 0,05 mg/kg/día mediante inyección intraperitoneal todos los días. Las administraciones de 19,20-EpDPE mejoraron significativamente la PH al suprimir la remodelación vascular pulmonar avanzada, incluida la fibrosis perivascular, tanto en los ratones WT como en los ratones Pafah2 KO, pero el DHA o el epóxido ω-6, 14,15-EET, no exhibieron los efectos beneficiosos (Fig. 5a-d, Fig. complementaria 10a-d).

una imagen representativa de la tinción EVG (arriba) y la inmunotinción de vimentina y CD31 (abajo) en pulmones de ratones WT expuestos a hipoxia y ratones Pafah2 KO cuando se les administró PBS, DHA (0,05 mg/kg/día) o 19,20-EpDPE (0,05 mg/kg/día) ip todos los días. Estas administraciones se iniciaron 2 semanas después de la exposición hipóxica. Barra de escala, 50 μm. b–d La evaluación de la gravedad de la HP en ratones WT expuestos a hipoxia y ratones Pafah2 KO cuando se les administró PBS, DHA o 19,20-EpDPE (ratones WT, n = 6,6,7; ratones Pafah2 KO, n = 7, 6,7). Grosor de la pared de las arteriolas pulmonares (b), RVSP (c), proporción de peso de RV a LV + tabique (d). Los experimentos se repitieron dos veces y los datos se agruparon (c, d). e Imagen representativa de la tinción EVG (arriba) y la inmunotinción de vimentina y CD31 (abajo) en pulmones de ratones WT tratados con Sugen/hipoxia cuando se les administró vehículo, DHA (0,05 mg/kg/día) o 19,20-EpDPE (0,05 mg /kg/día) ip todos los días. Estas administraciones se iniciaron 3 semanas después de la exposición hipóxica. Barra de escala, 50 μm. f–h La evaluación de la gravedad de la PH en ratones WT tratados con Sugen/hipoxia cuando se les administró PBS, DHA o 19,20-EpDPE (n = 6,5,6). Grosor de la pared de las arteriolas pulmonares (f), RVSP (g), relación de peso de RV a LV + tabique (h). Los datos son la media ± SEM. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett.

Además, evaluamos la eficacia de los epóxidos ω-3 en un modelo de ratón con PH Sugen/hipoxia, que mostró un fenotipo de PH más grave. La administración de 19,20-EpDPE, pero no de DHA, atenuó la gravedad de la PH en los ratones Sugen/hipoxia (Fig. 5e-h), como se observa en el modelo de PH hipóxico crónico. Estos resultados indican que la suplementación in vivo con epóxidos ω-3 puede ser un tratamiento viable para la HP.

Con el fin de investigar si las anomalías de PAF-AH2 estaban involucradas en el desarrollo de PAH humana, buscamos variantes patogénicas en Pafah2 entre pacientes con HP utilizando la secuenciación del exoma completo. Analizamos muestras de sangre de 262 pacientes, incluidos 90 HAP idiopática, 61 HAP hereditaria y 54 HAP asociada a enfermedades del tejido conectivo (Tabla complementaria 1). Encontramos dos variantes importantes de Pafah2, p.Arg85Cys (R85C)/c.253C>T y p.Gln184Arg (Q184R)/c.551A>G, que se suponía que eran altamente patogénicas en tres pacientes con PAH (Tabla complementaria 2) . Estos SNP tenían puntuaciones altas de Agotamiento Dependiente de la Anotación Combinada (CADD) que indicaban una alta patogenicidad. Además, estas variantes se encontraron en un sitio diferente de los sitios catalíticos de Pafah2 (Fig. 6a). Usando el modelo de homología de las proteínas PAF-AH2 como modelo inicial, se demostró que las variantes simuladas de PAF-AH2 p.R85C y PAF-AH2 p.Q184R tenían cambios conformacionales en comparación con la proteína nativa (Fig. 6b). Además, examinamos los impactos de las variantes de Pafah2 al expresar las proteínas mutantes usando vectores pcDNA in vitro. Los niveles de las proteínas mutantes, PAF-AH2 p.R85C y p.Q184R, se redujeron significativamente en relación con los de la PAF-AH2 nativa, pero el nivel de PAF-AH2 S236C, una variante en el sitio catalítico, no se modificó ( Figura 6c). Curiosamente, el tratamiento con MG132, un inhibidor del proteasoma, recuperó parcialmente los niveles de proteína de PAF-AH2 p.R85C y p.Q184R (Fig. 6c), lo que sugiere que la degradación de la proteína se debió al sistema de proteasoma de ubiquitina. En conjunto, se consideró que las variantes Pafah2 p.R85C y p.Q184R encontradas en pacientes con HAP contribuyen a la progresión de la HP al aumentar la vulnerabilidad de la proteína PAF-AH2 a la degradación.

un Diagrama esquemático de las ubicaciones de 2 candidatos a mutaciones patogénicas en el gen Pafah2 humano. b El modelo estructural de PAF-AH2 variante p.R85C (amarillo a la izquierda), variante p.Q184R (amarillo a la derecha) y forma nativa (azul), que muestra las instantáneas apiladas de 300 fotogramas obtenidos del fotograma 2700–3000 (correspondientes a 54–60 nanosegundos). Las flechas muestran la conformación modificada en cada modelo variante en comparación con el modelo de forma nativa. c Transferencia Western de PAF-AH2 en células HEK 293 que expresan variantes humanas de Pafah2 usando vectores pcDNA cuando se tratan con o sin MG132 (10 μM) durante 6 h (arriba) y cuantificación por densitometría (abajo). Los experimentos se repitieron cuatro veces y los datos se agruparon. d Resumen gráfico. Los datos son la media ± SEM. Los valores de P se determinaron mediante ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Tukey.

En este estudio, demostramos que los epóxidos ω-3 contrarrestan el desarrollo de HP mediante la regulación de la remodelación vascular de las arterias pulmonares. Esto se basa en nuestros hallazgos de que (a) los epóxidos ω-3 en el tejido pulmonar disminuyeron con la progresión de la PH, (b) la PH se exacerbó en los ratones que carecían de PAF-AH2, una enzima productora de epóxido ω-3, y ( c) la suplementación con epóxidos ω-3 atenuó la severidad de la HP en varios modelos de enfermedad.

Los ácidos grasos epoxidados con un anillo de éter de 3 miembros son lípidos muy reactivos; por ejemplo, los ácidos grasos epoxidados derivados del ácido araquidónico (epoxieicosanoide; EET) tienen varias funciones que afectan varios procesos, como la angiogénesis y la antiinflamación, que contribuyen al mantenimiento de la homeostasis22,23,24. Por otro lado, se sabe que los ácidos grasos ω-3 tienen efectos bioprotectores, incluida la cardioprotección25,26,27, y en los últimos años se ha revelado que sus compuestos epoxi ejercen fuertes efectos fisiológicos únicos, como antiinflamatorios, vasodilatadores y tumorales. -efectos supresores28,29,30,31,32,33,34. Curiosamente, la acción antifibrótica y la mejora del PH ejercida por los epóxidos ω-3 observados en este estudio no se pudo confirmar cuando los ácidos grasos ω-3 (EPA y DHA) se administraron a la misma dosis, lo que sugiere que estas funciones son específicas de Epóxidos ω-3. Aunque sus puntos de acción no se han identificado definitivamente en detalle hasta el momento, la vía de señalización de TGF-β puede estar involucrada en el mecanismo subyacente ya que 19, 20-EpDPE, un epóxido ω-3, suprimió significativamente la fosforilación de Smad2, que es estimulado por TGF-β, en fibroblastos de pulmón.

La selectividad de sustrato de PAF-AH y PAF-AH2 de tipo plasma es similar16. Además del PAF, ambos PAF-AH pueden hidrolizar fosfolípidos con cadena de acilo graso sn-2 corta y/o oxidada, pero difícilmente hidrolizan fosfolípidos con dos cadenas de acilo graso largas. Recientemente ha quedado claro que ambos PAF-AH pueden hidrolizar fosfolípidos oxidados no fragmentados, como los fosfolípidos que contienen isoprostano F2, a un ritmo lento. Además, el PAF-AH de tipo plasma también puede hidrolizar hidroperóxidos de fosfolípidos. Por otro lado, recientemente se ha demostrado que PAF-AH2 tiene la actividad única de liberar epóxidos ω-3 de los fosfolípidos15. Evaluamos la gravedad de la PH hipóxica en ratones Pla2g7 KO, pero no se observaron diferencias significativas con respecto a los ratones WT. Por lo tanto, determinamos que el fenotipo agravado de la PH hipóxica era específico de los ratones Pafah2 KO y que los epóxidos ω-3 producidos por PAF-AH2 estaban estrechamente relacionados con la gravedad de la PH. El papel del PAF-AH de tipo plasmático en la HP hipóxica nunca se ha informado y sigue siendo relativamente desconocido. En este estudio, la tasa de supervivencia de los ratones Pla2g7 KO con PH hipóxico no es significativa pero es peor que en los ratones de control con PH hipóxico (Fig. 2h), lo que sugiere que la PAF-AH de tipo plasma podría contribuir a la vulnerabilidad contra el PH hipóxico o la hipoxia. sí mismo.

La especificidad del tipo de célula también difiere entre las dos enzimas. El PAF-AH de tipo plasmático, que es secretado por monocitos, macrófagos y linfocitos T, se expresa predominantemente en el área rica en macrófagos en las placas ateroscleróticas35. Por el contrario, PAF-AH2 se expresa en hepatocitos, células epiteliales tubulares renales y se expresa en gran medida en mastocitos36. Los mastocitos contienen una cantidad considerable de PAF-AH2, lo que sugiere que esta enzima es esencial para las funciones de los mastocitos. Shimanaka et al. han demostrado que los epóxidos ω-3 producidos por PAF-AH2 promueven la desgranulación en los mastocitos, lo que juega un papel importante en la inflamación alérgica15. Por otro lado, nuestro estudio mostró que los epóxidos ω-3 de los mastocitos desempeñan un papel bioprotector en los pulmones cuando se exponen a la hipoxia. Además, Shimanaka et al. informaron que los epóxidos ω-3 actuaron dentro de los mastocitos15; mientras que en nuestro estudio, fueron liberados de la célula para actuar sobre otras células circundantes. De hecho, dado que se detectaron epóxidos ω-3 en el sobrenadante del cultivo de las BMMC, se podría considerar que los mastocitos liberaron epóxidos ω-3 al espacio extracelular. Curiosamente, se sabe que los mastocitos se desgranulan ligeramente incluso cuando se exponen a la hipoxia37, pero no se observaron diferencias significativas en los BMMC WT y los BMMC Pafah2 KO, lo que indica que los epóxidos ω-3 no afectaron la desgranulación independiente de IgE inducida por hipoxia. .

Los mastocitos están ampliamente presentes en los pulmones, ya que son las principales células inflamatorias pulmonares y están estrechamente asociados con reacciones alérgicas como el asma38. Se ha informado que los mastocitos están involucrados en la patogenia de la HP, y se cree que la desgranulación de los mastocitos promueve la inflamación y exacerba la HP18,19,39,40. Sin embargo, se sabe que los mastocitos también poseen propiedades antiinflamatorias41,42. Por lo tanto, en estudios que utilizan ratones deficientes en mastocitos, queda por determinar si los mastocitos son beneficiosos o perjudiciales para la HP. En nuestro estudio, la administración de ketotifeno, un supresor de la desgranulación de los mastocitos, no afectó la gravedad de la HP hipóxica en ratones. Por lo tanto, bajo las condiciones de este estudio, los mastocitos no exacerbaron el estado patológico por desgranulación, sino que suprimieron la progresión de la HP al liberar epóxidos ω-3.

En los últimos años se han desarrollado varios modelos animales de PH y se deben comprender las limitaciones de cada modelo. El modelo de HP liderado por la hipoxia sola puede clasificarse mejor como HP del grupo III (HP por enfermedades pulmonares y/o hipoxia) que como HP del grupo I (HAP). En este estudio, para aclarar la relación entre una molécula específica y la fisiopatología de la HP utilizando ratones genéticamente modificados, primero usamos un modelo de un solo golpe con solo estimulación hipóxica. Los resultados experimentales del modelo de PH hipóxico podrían explicar parcialmente el mecanismo común que subyace a la PH. Sin embargo, también fue necesario utilizar el modelo animal en el que la severidad y los cambios tisulares fueron similares a los del grupo I PH. Para demostrar la importancia y la eficacia del eje epóxido PAF-AH2-ω-3 en PAH, realizamos experimentos en los que se administraron epóxidos ω-3 a los ratones Sugen/hipoxia PH en el presente estudio.

Se cree que la remodelación vascular en la HP se debe principalmente a anomalías en las células del endotelio vascular y las células del músculo liso. Sin embargo, los ratones Pafah2 KO con HP hipóxica mostraron una marcada fibrosis perivascular, lo que sugiere que la fibrosis afectó fuertemente la exacerbación de la HP. Curiosamente, los epóxidos ω-3 no cambiaron significativamente la expresión génica y la proliferación celular de las células endoteliales de la arteria pulmonar y las células del músculo liso in vitro. Además, los mastocitos que liberaban epóxidos ω-3 en su entorno se localizaron en el espacio intersticial alrededor de los vasos sanguíneos, lo que sugirió que los fibroblastos perivasculares eran el objetivo de los epóxidos ω-3.

En este estudio, identificamos mutaciones de sentido erróneo que estaban estrechamente asociadas con la patogenicidad de la HP utilizando un programa predictivo (puntuación CADD >30; SIFT, perjudicial; Polyphen; probablemente perjudicial) a partir de datos de secuenciación del exoma completo en pacientes con PAH. La mayoría de los pacientes con estas mutaciones respondieron mal a los agentes terapéuticos existentes, principalmente vasodilatadores. Además, los experimentos que utilizaron el vector de expresión en células cultivadas revelaron un nivel reducido de proteína expresada asociado con las dos mutaciones. Se intentó la expresión forzada de PAF-AH2 en BMMC con el vector de plásmido pero no tuvo éxito. Por lo tanto, las células HEK293, que son células derivadas de seres humanos que producen una cantidad suficiente de proteína diana a través de la transfección del vector plasmídico y tenían una baja producción endógena de proteína PAF-AH2, se seleccionaron como células transfectadas. Dado que el tratamiento con un inhibidor del proteosoma restaura los niveles de las proteínas mutantes, creemos que las modificaciones postraduccionales, como la ubiquitinación, están involucradas en la reducción debido a las mutaciones. En el futuro, se debe generar un ratón knock-in de PAF-AH2 humano que albergue estas mutaciones para determinar si la PH se desarrollaría o mostraría una exacerbación de forma natural.

El tratamiento principal para la HP incluye la vasodilatación funcional por varios agentes terapéuticos, incluyendo la prostaglandina I2, el óxido nítrico y la inhibición de la fosfodiesterasa-5; sin embargo, no existen fármacos modificadores de la enfermedad fundamentales que puedan suprimir la progresión de la HP. La remodelación de la arteria pulmonar, que involucra células inflamatorias como los mastocitos, se considera un mecanismo subyacente clave en la HP. En este estudio, revelamos que los epóxidos ω-3 producidos por los mastocitos pulmonares eran candidatos para un fármaco terapéutico eficaz que suprime la remodelación vascular pulmonar. En el futuro, esperamos desarrollar un método terapéutico valioso utilizando epóxidos ω-3 con el fin de suprimir la remodelación vascular pulmonar en pacientes con HAP con mutaciones en PAF-AH2 que no pueden tratarse de manera efectiva con dilatadores de la arteria pulmonar.

Todos los procedimientos del presente estudio se ajustaron a los principios descritos en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU. y fueron aprobados por el Centro de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio (No. D2012 -021 y N° 15063).

Los ratones Pafah2 KO se retrocruzaron con ratones C57BL/6 durante más de 10 generaciones36. Los ratones Pla2g7 KO (antecedentes C57BL/6J) fueron amablemente recibidos del Dr. Stafforini (Universidad de Utah). Los ratones macho se usaron para todos los experimentos, excepto para los de la Fig. 3 complementaria. En todos los experimentos con ratones KO (7 a 10 semanas), se usaron ratones C57BL / 6J de la misma edad y sexo como controles. Se adquirieron ratones mutantes Kit deficientes en mastocitos (C57BL/6J-Kit W-sh/W-sh) de Jackson Laboratories. Todos los ratones se alojaron en instalaciones libres de patógenos específicas con clima controlado (23 °C) con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h, con libre acceso a alimentos de laboratorio estándar (CE2; CLEA Japan Inc.) y agua en la Universidad de Keio.

EPA, DHA, AA, 17,18-EpETE, 19,20-EpDPE, 17,18-diHETE, 19,20-diHDoPE, 14,15-EET y otros metabolitos de ácidos grasos se obtuvieron de Cayman Chemical.

Se recogieron tejidos de pulmón derecho murino y se colocaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Después de la trituración por congelación de las muestras, los lípidos se extrajeron por el método de Bligh y Dyer43. Las soluciones extraídas se secaron con evaporador centrífugo, se disolvieron en metanol: isopropanol = 1:1 y se almacenaron a -20 °C. Los metabolitos de ácidos grasos se purificaron aún más de los tejidos mediante extracción en fase sólida utilizando columnas InertSep NH2 (GL Science) con patrón interno marcado con deuterio (11(12)-EET-d11). Brevemente, las columnas InertSep NH2 se preacondicionaron con 6 ml de hexano y los lípidos extraídos de los tejidos mediante el método de Bligh y Dyer se aplicaron con 500 μL de cloroformo. A continuación, las columnas se lavaron con 6 ml de cloroformo/isopropanol (2/1, v/v), seguido de elución con éter dietílico/ácido acético (98/2, v/v). Las soluciones extraídas se secaron con evaporador centrífugo, se disolvieron en metanol: isopropanol = 1:1 y se almacenaron a -20 °C44.

Para la detección de metabolitos de ácidos grasos, se realizaron análisis de lipidómica basados ​​en LC/ESI-MS en un sistema Shimadzu Nexera UPLC (Shimadzu) acoplado con un espectrómetro de masas de trampa de iones lineal triple cuadrupolo híbrido QTRAP 4500 (AB SCIEX). La separación cromatográfica se realizó en una columna ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 µm; Waters) mantenida a 40 °C usando la fase móvil A (agua/ácido acético (100/0,1, v/v) que contenía acetato de amonio 10 mM ) y fase móvil B (acetonitrilo/metanol (4/1, v/v) que contiene acetato de amonio 10 mM) en un programa de gradiente (0–2 min: 90 % A; 2–10 min: 90 % A → 30 % A ; 10–24 min: 30 % A → 27 % A; 24–27 min: 1 % A; 27–32 min: 90 % A) con un caudal de 0,2 ml/min (0–10 min), 0,1 ml /min (10-15 min), 0,2 ml/min (15-24 min) y 0,5 ml/min (24-32 min). Los parámetros del instrumento fueron los siguientes: cortina de gas, 10 psi; voltaje de pulverización de iones, −4500 V; temperatura, 600 °C; gas fuente de iones 1, 70 psi; gas fuente de iones 2, 80 psi. La detección específica fue realizada por MRM como se describió previamente15,44.

En el modelo de ratones con hipoxia crónica, los ratones se alojaron en una cámara hipóxica (10% O2) mantenida usando un generador de aire hipóxico (TEIJIN) y monitoreada con un analizador de O2 (JIKO-255), durante 4 u 8 semanas. El modelo de ratones Sugen/hipoxia se generó de acuerdo con un informe anterior45. En resumen, 20 mg/kg de inhibidor de VEGF, Sugen (SU5416; S8442, Sigma-Aldrich), que se suspendió en CMC (0,5 % [p/v] de carboximetilcelulosa sódica, 0,9 % [p/v] de cloruro de sodio, 0,4 % [v/v] polisorbato 80, alcohol bencílico al 0,9 % [v/v] en agua desionizada), se inyectó por vía subcutánea en ratones (C57BL/6J) los días 0, 7 y 14. Los ratones se alojaron en una cámara hipóxica ( 10% O2) durante 7 semanas. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar. Los estudios se realizaron de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Cada ratón se anestesió usando isoflurano al 1,5% en una tabla de calor y se controló la frecuencia cardíaca y mediante electrocardiograma. Se insertó un catéter de micropunta (Millar) en el RV a través de la vena yugular derecha para medir la RVSP. Las mediciones hemodinámicas se analizaron utilizando Lab Chart 8 (instrumentos AD). Se extrajo el corazón para la evaluación de la hipertrofia del VD [proporción de peso del VD y (ventrículo izquierdo + tabique)] y la extracción de ARN, y los pulmones se prepararon para el análisis morfométrico y la extracción de ARN.

Las células BM obtenidas de ratones se cultivaron en medio completo BMMC que contenía IL-3 que comprendía DMEM, FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 μg/ml, aminoácidos no esenciales 100 mM y 5 ng /ml de rIL-3 de ratón para preparar BMMCs46. Después de 4 a 6 semanas de cultivo, se confirmó que >95 % de las células flotantes eran mastocitos Kit+ FcεRI+ mediante citometría de flujo. La desgranulación de las BMMC se evaluó por las cantidades de β-HEX liberadas en un ensayo enzimático usando 4-nitrofenil N-acetil-β-glucosaminida.

Para obtener medios acondicionados de BMMC, se cultivaron 1 × 107 BMMC en medio completo de BMMC que contenía IL-3 durante 2 días. Los lípidos neutros, los fosfolípidos y los ácidos grasos libres se extrajeron de los medios acondicionados mediante extracción en fase sólida utilizando cartuchos Sep-Pak C18 (Waters). Brevemente, el medio acondicionado se añadió a las columnas Sep-Pak y los lípidos neurales se eluyeron con 10 ml de hexano. Los ácidos grasos libres se eluyeron posteriormente con 10 ml de formiato de metilo. Los fosfolípidos finalmente se eluyeron con 10 ml de metanol. La fracción de ácidos grasos libres se utilizó como experimentos.

Las BMMC (5 × 106 células) se reconstituyeron mediante inyección intravenosa en ratones macho Kit W-sh/Wsh de 6 semanas de edad. Cuatro semanas después de la reconstitución, los ratones se sometieron a hipoxia para inducir la PH. La distribución y maduración de las BMMC reconstituidas en los pulmones se evaluaron mediante tinción con azul de toluidina o inmunotinción fluorescente.

La sal de fumarato de ketotifeno (Sigma) se disolvió en H2O y se administró por vía oral a ratones durante 4 semanas en condiciones hipóxicas. Los consumos de agua potable en ratones con el grupo al que se administró ketotifeno no fueron diferentes de los del grupo de control.

Se contaron los mastocitos positivos para azul de toluidina a lo largo de la sección del pulmón, que se midieron en al menos 20 secciones en cada ratón bajo un microscopio óptico. Los mastocitos perivasculares se clasificaron en granulados y desgranulados según la extrusión de los gránulos secretores18. Los mastocitos granulados tienen un citoplasma denso, mientras que los mastocitos desgranulados tienen un citoplasma ligero con puntos vacíos debido a la descarga de gránulos secretores. Se calculó un índice de granulación como la proporción del número de mastocitos granulados/número de mastocitos desgranulados.

Se recogieron los pulmones de los ratones, se inflaron a través de la tráquea con paraformaldehído al 4 % a una presión de 25 cmH2O y luego se fijaron en paraformaldehído al 4 %. Las muestras se incluyeron en parafina y se seccionaron a 4 μm de espesor, y se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE), Elastica-van Gieson (EVG) y tinción con azul de toluidina. Se eligieron aleatoriamente al menos 10 vasos periféricos (<100 μm de diámetro) que exhibían un perfil circulatorio aproximado en cada sección de pulmón y se analizó el porcentaje de grosor de la pared utilizando la siguiente fórmula: [(diámetro vascular - luz vascular)/diámetro vascular] × 100. Todos Los análisis morfométricos se realizaron simultáneamente y sin conocer las condiciones del estudio.

Para la inmunohistoquímica de las secciones de parafina de pulmón, la recuperación de las secciones de parafina se realizó utilizando una solución de recuperación (solución de recuperación de destino S1700, Dako) en un baño de agua hirviendo durante 20 min. Las secciones se enfriaron a temperatura ambiente durante 30 min. Después del lavado, las secciones se incubaron con el anticuerpo primario (anti-CD31 [E-AB-70021; Elabscience; 1:200] para muestras de ratón o anti-CD31 [ab182981; Abcam; 1:2000] para muestras humanas) a 4 °C durante la noche. El anticuerpo primario se visualizó usando IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; 1:2000). Para la contratinción con vimentina, la inmunotinción se realizó con el kit de inmunodetección de fluoresceína anti-vimentina (ab8978; Abcam; 1:200) y MOM con kit de bloqueo de avidina/biotina (Vector Laboratories) y estreptavidina Texas Red (Vector Laboratories), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. protocolo. Para la contratinción con triptasa y PAF-AH2, la inmunotinción se realizó con el kit de inmunodetección de fluoresceína anti-triptasa (NPB2-26444; Novus; 1:100) y MOM con kit de bloqueo de avidina/biotina y estreptavidina AMCA (Vector Laboratories). El anticuerpo monoclonal anti-PAF-AH2 TI1036 (1:100) se marcó con el kit de etiquetado HiLyte Fluor 555 (Dojindo Molecular Technologies). Las secciones se montaron con fluoromount-G con DAPI (Invitrogen) o Fluoromount (Diagnostic BioSystems). Las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia (BZ-9000; Keyence).

Para las "Figuras complementarias", la inmunotinción de secciones de parafina de pulmón murino se realizó utilizando los anticuerpos primarios (anti-podoplanina; AF3244; R&D Systems; 1:40, anti-Mac3; 550292; BD Biosciences; 1:100 y anti-Vimentin; ab92547; Abcam; 1:200) y visualizados usando IgG anti-cabra de burro conjugada con Alexa 546, IgG anti-rata de cabra conjugada con Alexa546 o IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 594 (Invitrogen; 1:2000), respectivamente. Para la contratinción con PAF-AH2, la inmunotinción se realizó con el anticuerpo monoclonal anti-PAF-AH2 TI10 (1:100) y el kit de inmunodetección de fluoresceína MOM con kit de bloqueo de avidina/biotina y fluoresceína avidina DCS (Vector Laboratories). En la inmunotinción de secciones de parafina de pulmón humano, los anticuerpos primarios (anti-podoplanina; AF3670; R&D Systems; 1:100, anti-CD68; #76437; Cell Signaling Technology; 1:200 y anti-Vimentin; ab92547; Abcam; 1 :200) fueron utilizados y visualizados por IgG anti-oveja de burro conjugada con Alexa594 o IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa594 (Invitrogen; 1:2000), respectivamente. Para la contratinción con PAF-AH2, se usaron anticuerpo anti-PAF-AH2 TI10 (1:100) e IgG anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 488 (1:2000).

Los fibroblastos de pulmón primarios sembrados en una placa base de vidrio de 35 mm (Iwaki) se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % durante 10 min, luego se bloquearon con suero al 1 % durante una hora. Las células se tiñeron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Se incubó IgG anti-conejo/ratón de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; 1:2000) durante una hora a temperatura ambiente coteñida con DAPI. Los anticuerpos primarios utilizados en el presente estudio fueron anti-SM22α (ab14106; Abcam; 1:100) y anti-PCNA (ab29; Abcam; 1:100). Las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia (BZ-9000; Keyence).

Los pulmones se perfundieron y digirieron con colagenasa II (Worthington Biochemical Crop). Las células disociadas se incubaron durante una hora. Las células restantes se resuspendieron en DMEM (Wako) que contenía suero bovino fetal al 10% y se colocaron en placas de cultivo Primaria (BD). Después de 24 h, se cambió el medio de cultivo. Después de otros 3 y 5 días, los cultivos de fibroblastos se sometieron a pases y se usaron en los experimentos.

Se sembraron fibroblastos de pulmón y células de músculo liso en placas de 96 pocillos. Después de 12 h, se agregaron epóxidos ω-3 o extractos de lípidos a las placas y se observaron proliferaciones celulares durante 48 h utilizando RealTime-Glo MT Cell Viability Assay (Promega) durante 48 h en un lector de microplacas (Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments ).

La migración celular se realizó utilizando un ensayo de cámara de Boyden con cámaras de invasión de membrana de 24 pocillos y tamaño de poro de 8 μm (ThermoFisher). Se sembraron 2 × 104 células en la cámara superior del transwell. Se añadieron epóxidos omega-3 o ácidos grasos ω-3 a la cámara inferior. Después de 24 h, las membranas con células migradas se fijaron con metanol y se tiñeron con azul de toluidina. Las imágenes se adquirieron con un microscopio (BZ-9000; Keyence) y el número de células migratorias se cuantificó mediante campos aleatorios de 10x.

Se cultivaron células endoteliales pulmonares humanas (Gibco) en CO2 al 5 % a 37 °C utilizando medio EGM-2 BulletKit (CC-3162; Lonza). También se cultivaron células de músculo liso arterial pulmonar humano (Kurabo) utilizando DMEM (Wako) que contenía medio de suero bovino fetal al 20%. Las células se usaron entre los pasajes 4–8.

Las mediciones de los niveles intercelulares de especies reactivas de oxígeno se realizaron utilizando el kit de ensayo Cellular ROS (abcam). Se sembraron células endoteliales de arteria pulmonar humana en placas de 96 pocillos. Después de 12 h, se añadieron epóxidos ω-3 o ácidos grasos ω-3 a las placas con o sin estimulación con H2O2 (500 μM o 1 mM). Una hora después, se añadió diacetato de 2′,7′-diclorofluorescina a las placas y se midió la 2′,7′-diclorofluorescina por espectroscopía de fluorescencia con excitación/emisión a 485 nm/535 nm en un lector de microplacas (Gen5 Synergy HTX; BioTek instrumentos).

Se sembraron células endoteliales de arteria pulmonar en placas de 96 pocillos. Después de 12 h, se añadieron epóxidos ω-3 o ácidos grasos ω-3 a las placas con o sin estimulación con H2O2 (500 μM o 1 mM). Dos horas después, se midió el número de células viables utilizando el ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo (Promega) en un lector de microplacas (Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments).

Usamos los vectores de plásmido pcDNA3.1(+) (V790202, Invitrogen) que llevan un ADNc de Pafah2 humano de longitud completa (secuencia de referencia NCBI: NM_000437.4) clonado de la biblioteca de ADNc de cerebro humano (Life Technologies, Inc.)47. Con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quik Change (Agilent) de acuerdo con el manual de instrucciones, introdujimos la sustitución de una sola base en el plásmido que porta el cDNA nativo de Pafah2 para generar las variantes R85C (253C>T), Q184R (551A>G) y S236C (707C>G) y confirmó la presencia de mutaciones por secuenciación de ADN. Se transfectaron plásmidos pcDNA de Pafah2 nativos o mutantes (3,5 μg por placa de 6 pocillos) en células HEK293 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 48 h, se cambió el medio de cultivo y se expuso a DMEM con o sin MG132 (10 μM) durante 6 h. Posteriormente, se recogieron las células y se analizó la cantidad de proteína PAF-AH2 expresada mediante transferencia Western. Se utilizaron como controles células HEK293 transfectadas con vectores pcDNA vacíos.

Se prepararon cantidades iguales de la proteína total aislada de pulmones murinos, fibroblastos de cultivo primario o células HEK293 en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, y dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1 %, y complementado con ditiotreitol (DTT) 1 mM, MG132 100 nM, cóctel inhibidor de proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa (Nacalai Tesque). Para el análisis de transferencia Western, se sometieron cantidades iguales de proteína total (10–15 μg) del lisado a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Los anticuerpos primarios utilizados en el presente estudio fueron anti-PAF-AH2 (TI10; 1:1000), anti-β-actina (sc-47778; Santa Cruz Biotechnology; 1:1000), anti-p-Smad 2 S465/467 (n.º 3108) y anti-Smad 2 (n.º 5339) (Tecnología de señalización celular; 1:1000). Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:2000) y quimioluminiscencia mejorada (Chemi-Lumi One Super; Nacalai Tesque) en un LAS-4000 mini (GE Healthcare). Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando ImageJ ver1.52.

Para la PCR cuantitativa en tiempo real, se prepararon muestras de ARN total de pulmones, RV o fibroblastos de pulmón utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen). Las muestras de ARN total (0,2–0,5 μg) se transcribieron de forma inversa utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). La expresión cuantitativa del ARNm se evaluó mediante PCR en tiempo real utilizando THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo). Las muestras se procesaron en ViiA7 (Applied Biosystems) y los datos se analizaron mediante el método delta-delta CT. El ARN ribosomal 18S fue amplificado y utilizado como control interno. Las secuencias de los cebadores para los genes se enumeran en la Tabla complementaria S3.

Este estudio ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del hospital de la Universidad de Keio (IRB No: 20140203), y todas las pruebas genéticas se realizaron con el consentimiento informado de los pacientes después del asesoramiento genético. Incluimos y analizamos muestras de sangre de 262 pacientes, incluidos 90 HAP idiopática, 61 HAP hereditaria y 54 HAP asociada a enfermedades del tejido conjuntivo (edad media, 45,5 ± 16,6 años; mujeres, 78,0 %; presión arterial pulmonar media, 42,9 ± 15,5 mmHg) . Realizamos la secuenciación del exoma completo utilizando una plataforma HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) y el kit SureSelectXT Human All Exon (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) para la captura de hibridación. La patogenicidad de las variantes se evaluó con CADD, SIFT y PolyPhen-248,49. En cuanto a las variantes del gen Pafah2 en los datos de secuenciación del exoma completo de pacientes con HP, seleccionamos mutaciones sin sentido con una puntuación CADD igual o superior a 30 (MIS30). Los genes conocidos relacionados con la hipertensión arterial pulmonar (HAP) incluyen el gen del receptor de la proteína morfogenética ósea tipo 2 (BMPR2), el gen similar al receptor 1 de la activina A (ACVRL1), el gen de la endoglina (ENG), el gen de la caveolina-1 (CAV-1), el gen T -gen de la caja 4 (TBX4), gen del miembro 3 de la subfamilia K del canal de potasio (KCNK3), factor de traducción de iniciación eucariota 2 a quinasa 4 (EIF2AK4), SMAD, trifosfato de adenosina 13A3 (ATP13A3), gen de acuaporina 1 (AQP1), factor de diferenciación del crecimiento 2 (GDF2) y el gen 17 del miembro de la familia de cajas de grupo de alta movilidad relacionado con SRY (SOX17), que se seleccionaron de acuerdo con el informe anterior48.

El modelo estructural 3D inicial de PAF-AH2 se obtuvo mediante el modelado de homología con SWISS-MODEL50. La estructura cristalina de PAF-AH de tipo plasma (número PDB: 5i9i.1.A) se usó como molde (identidad de secuencia 42,33 %, puntuación GMQE 0,74)51. La simulación de dinámica molecular se realizó en condiciones solubles en agua utilizando Nanoscale Molecular Dynamics (NAMD) versión 2.1252 con Chemistry at Harvard Molecular Mechanics (CHARMM) 36 campo de fuerza53. La posición y el vector de velocidad de cada átomo y molécula de agua se calcularon en cada 2,0 femtosegundos (1 × 10−15 s) y se utilizó la suma Ewald de malla de partículas (PME) con una longitud de corte de 12 Å para las interacciones directas. predicción de la interacción electrostática de largo alcance54. La simulación se realizó con las opciones de rigibBonds all y se neutralizó el sistema con NaCl en condiciones fisiológicas (150 mEq/l). Las moléculas de agua se modelaron como moléculas de agua con potencial intermolecular transferible (TIP3P). La estructura inicial de cada mutante se obtuvo induciendo la sustitución de aminoácidos contra la estructura inicial de tipo salvaje en condiciones solubles en agua utilizando el complemento de residuos mutados de Visual Molecular Dynamics (VMD) versión 1.9.352. La estructura estable de cada mutante junto con el tipo salvaje se calculó ejecutando la simulación durante 72 nanosegundos. Se utilizó la desviación cuadrática media (RMSD) para confirmar que el cálculo se ha estabilizado (Figura complementaria 11a-c). El RMSD se calculó con distancias relativas al modelo inicial. Mientras que el modelo inicial del tipo salvaje era el resultado inmediato del modelado de homología solvatado en agua, los modelos iniciales para los mutantes eran la estructura estable del tipo salvaje (después de una simulación de 60 nanosegundos). Todos los resultados se visualizaron usando VMD versión 1.9.3. La simulación se realizó con un tamaño límite de 7,37 nm × 8,34 nm × 8,22 nm con una condición de límite periódica. Los números de átomos fueron 46628, 46615 y 46635 para los modelos WT, R85C y Q184R (incluyendo aguas e iones) respectivamente. Las instantáneas apiladas de 300 fotogramas obtenidos del fotograma 2700–3000 (que corresponden a 54–60 nanosegundos), una ventana de tiempo que representa las fluctuaciones estructurales después de que el modelo se estabilizó, se mostraron como figuras.

Los datos se presentan como media ± SEM. La puntuación Z de los datos de lipidómica se calculó con Microsoft Excel 2019 y se mostró como un mapa de calor. La significación estadística de las diferencias entre los 2 grupos se determinó utilizando la prueba T de Student para datos no apareados. Las diferencias entre múltiples grupos se compararon utilizando ANOVA de una o dos vías seguido de pruebas post hoc. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 9. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y su información complementaria. Los datos de lipidómica se han depositado en Metabolomics Workbench con el número de acceso ST001951 (https://doi.org/10.21228/M8PH6J). La estructura cristalina de PAF-AH de tipo plasma utilizada en este estudio está disponible en Protein Data Bank con el número PDB: 5I9I (https://www.rcsb.org/structure/5I9I). Los datos de secuenciación del exoma completo no están disponibles públicamente debido a la presencia de información que podría comprometer la privacidad de los participantes de la investigación. Para obtener los datos a nivel individual seudonimizados, los investigadores deben comunicarse con el miembro principal del comité de acceso a datos (MK) en [email protected] y realizar las solicitudes científicamente adecuadas. En general, estos datos solo pueden usarse para investigación y no están disponibles para uso comercial. Todas las solicitudes deben detallar el propósito científico, los objetivos, los métodos, el cronograma, la gestión de datos, las consideraciones éticas, los asuntos financieros y los intereses contrapuestos, y también deben incluir un plan de proyecto e información sobre la entidad responsable de la investigación y el investigador principal. Todas las solicitudes serán revisadas por el IRB de la Universidad de Keio y requerirán que el investigador solicitante firme un acuerdo de acceso a datos con la Universidad de Keio. Las solicitudes de datos se procesarán en el plazo de 1 mes si se presenta una aprobación ética por escrito al autor. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Nos gustaría agradecer a Yoshiko Miyake (Universidad de Keio) y Seiichi Kotoda (empresa del centro de investigación Bio, Japón) por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) con el número de subvención JP22gm5910014 (JE) y JP22gm1210013 (NK), la Fundación de Investigación Médica SENSHIN (JE), la Fundación de Investigación Japonesa para Farmacología Clínica (JE) y la Beca de la Universidad de Keio -en-Ayuda para el Fomento de Jóvenes Científicos Médicos (HM).

Departamento de Cardiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, Tokio, Japón

Hidenori Moriyama, Jin Endo, Masaharu Kataoka, Shinichi Goto, Hiroki Kitakata, Takahiro Hiraide, Naohiro Yoshida, Sarasa Isobe, Tsunehisa Yamamoto, Kohsuke Shirakawa, Atsushi Anzai, Yoshinori Katsumata, Keiichi Fukuda y Motoaki Sano

Laboratorio de Química de la Salud, Escuela de Graduados en Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Yuta Shimanaka, Nozomu Kono y Hiroyuki Arai

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, Tokio, Japón

Yuki Sugiura y Makoto Suematsu

Centro de Genética Médica, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, Tokio, Japón

Kenjiro Kosaki

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HM y JE diseñaron y realizaron los experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. MK y TH recogieron las muestras de los pacientes y analizaron los datos. Y.Shimanaka, Y.Sugiura y NK realizaron un análisis lipidómico completo. SG realizó simulación de dinámica molecular. HK, NY, SI, TY, KS, AA e YK realizaron los experimentos y analizaron los datos. KK realizó la secuenciación exsoma completa. M.Suematsu, KF, HA y M.Sano diseñaron los experimentos e interpretaron los resultados.

Correspondencia a Jin Endo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Mark Nicolls, Wen Tian, ​​Karsten Weylandt y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Moriyama, H., Endo, J., Kataoka, M. et al. Los epóxidos de ácidos grasos omega-3 producidos por PAF-AH2 en los mastocitos regulan la remodelación vascular pulmonar. Nat Comun 13, 3013 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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Recibido: 03 Marzo 2021

Aceptado: 03 mayo 2022

Publicado: 31 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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